ε-聚赖氨酸对柑橘青霉病菌及酸腐病菌的抑制作用研究

摘要

中国是世界第一大水果柑橘的生产大国，柑橘成熟期集中且难以长时间储藏，在贮运过程中保鲜方式不当，易发生霉变、腐烂降低品质。柑橘采后主要的病害包括青霉病(Blue mold)和酸腐病(Sour rot)等，目前控制这两种病害以化学杀菌剂方法效果最好。但是化学杀菌剂存在易残留，损害人体身心健康和污染环境等问题，且长期广泛使用易引起病原菌产生耐药性，因此亟需开发一些安全高效的保鲜剂产品和保鲜技术，以减少化学杀菌剂的大量使用。　　ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，ε-PL)是一种高安全性、可生物降解的天然食品防腐剂，对环境和人体健康无毒性。本论文采用组织分离法从有典型青霉病、酸腐病的沙糖橘果实上分离纯化出致病真菌，经分子生物学等方法分别鉴定为意大利青霉(Penicillium italicum)、柑橘酸腐菌(Geotrichum candidum var. citri-aurantii)通过ε-PL对意大利青霉和柑橘酸腐菌的离体和活体抑菌试验，研究探讨ε-PL对意大利青霉和柑橘酸腐菌的抑菌活性，并进一步探究了ε-PL对意大利青霉、柑橘酸腐菌的抑菌作用机制。主要研究结果如下：　　1.从自然发病的沙糖橘果实表面分离得到2株致病真菌，经形态学鉴定、致病性检测以及rDNA-ITS序列分析将2株病原真菌分别鉴定为意大利青霉(Penicillium italicum)、柑橘酸腐菌(Geotrichum candidum var. citri-aurantii)。　　2.ε-PL对意大利青霉的最小抑菌浓度(MIC)为200mg/L，ε-PL对意大利青霉菌丝生长和孢子萌发抑制的半最大效应浓度(EC50)分别为142.35mg/L和167.55mg/L。400mg/L的ε-PL的对意大利青霉菌丝生长和孢子萌发抑制率为(87.55±0.19)%和(86.88±0.61)%。浓度为1200、2400、4800mg/L的ε-PL处理可显著降低柑橘果实酸腐病的损伤接种发病率和病斑直径(P＜0.05)。　　3.ε-PL对柑橘酸腐菌的最小抑菌浓度(MIC)为400mg/L，ε-PL对柑橘酸腐菌菌丝生长和孢子萌发抑制的半最大效应浓度(EC50)分别为128.79mg/L和214.77mg/L。800mg/L的ε-PL的对柑橘酸腐菌菌丝生长和孢子萌发抑制率为(99.88±0.20)%和(99.32±0.59)%浓度为1600、4800、6400mg/L的ε-PL处理可显著降低柑橘果实酸腐病的损伤接种发病率和病斑直径(P＜0.05)。　　4.分别经浓度为MIC和2MIC的ε-PL处理后的意大利青霉、柑橘酸腐菌胞外相对电导率，OD260值上升，表明经ε-PL处理后意大利青霉、柑橘酸腐菌的细胞膜通透性增加，核酸等胞内物质外渗流出，PI染色试验后，经MIC和2MIC的ε-PL处理后的意大利青霉、柑橘酸腐菌红色荧光信号明显高于对照组，表明ε-PL处理能够破坏意大利青霉、柑橘酸腐菌细胞膜的完整性。　　5.扫描电镜观察结果发现，ε-PL处理可改变意大利青霉、柑橘酸腐菌的菌丝体形态。经ε-PL处理后意大利青霉菌丝体由粗壮、均匀，形状规则变成干瘪、褶皱不规则的状态。经ε-PL处理可使柑橘酸腐菌菌丝体由表面光滑、结构完整，隔膜明显状态转变为表面严重褶皱、膨大凸起，整体扭曲变形，菌丝断裂状态。　　6.ε-PL具有抑菌作用，其可能是通过破坏意大利青霉、柑橘酸腐菌的细胞膜结构而导致菌体细胞内容物外渗，进而影响细胞的生长代谢，使菌丝体形态结构畸变与孢子萌发受阻，进而抑制了菌体细胞的生长繁殖。

目录

声明

中英文缩略对照表

第1章 绪 论

1.1 柑橘概述

1.1.1 我国柑橘产业生产现状

1.1.2 柑橘贮藏期间主要的侵染性病害

1.2 柑橘贮藏保鲜技术

1.2.1 物理保鲜技术

1.2.2 化学保鲜技术

1.2.3 生物保鲜技术

1.3 ε-PL 的简介

1.3.1 ε-PL 的结构及性质

1.3.2 ε-PL 的抑菌活性

1.3.3 ε-PL 的应用

1.4 论文的选题依据及主要研究内容

1.4.1 论文的选题意义

1.4.2 主要研究内容

第2章 柑橘青霉病和酸腐病致病菌的分离鉴定

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料及试剂

2.1.2 仪器与设备

2.2 试验方法

2.2.1 柑橘采后病原微生物的分离和纯化

2.2.2 病原菌的形态学鉴定

2.2.3 病原菌的致病性试验

2.2.4 病原菌的分子生物学鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 病原菌的形态学鉴定

2.3.2 病原菌致病性试验

2.2.3 病原菌分子生物学鉴定

2.4 本章小结

第 3 章 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌的抑菌效果

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料及试剂

3.1.2 仪器与设备

3.2 试验方法

3.2.1 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌抑菌圈直径的测定

3.2.2 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌最小抑菌浓度(MIC)的测定

3.2.3 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌菌丝生长抑制率的测定

3.2.4 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌孢子萌发抑制率的测定

3.2.5 ε-PL 处理对柑橘果实青霉病和酸腐病发病率和病斑直径的影响

3.2.6 数据分析与处理

3.3 结果与分析

3.3.1 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌的抑菌圈直径

3.3.2 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌的最小抑菌浓度(MIC)

3.3.3 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌菌丝体生长的影响

3.3.4 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌孢子萌发的影响

3.3.5 ε-PL 处理对柑橘果实青霉病和酸腐病的防治效果

3.4 本章小结

第 4 章 ε-PL 对意大利青霉和柑橘酸腐菌抑菌机制

4.1 材料与仪器

4.1.1 材料及试剂

4.1.2 仪器与设备

4.2 试验方法

4.2.1 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌细胞膜通透性的影响

4.2.2 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌胞内物质释放的影响

4.2.3 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌细胞膜完整性的影响

4.2.3 扫描电子显微镜观察 ε-PL 处理后意大利青霉和柑橘酸腐菌菌丝体的形态学变化

4.3 结果与分析

4.3.1 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌细胞膜通透性的影响

4.3.2 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌胞内物质释放的影响

4.3.3 ε-PL 处理对意大利青霉和柑橘酸腐菌细胞膜完整性的影响

4.3.4 扫描电子显微镜观察 ε-PL 处理后意大利青霉和柑橘酸腐菌菌丝体的形态学变化

4.4 本章小结

结 论

参考文献

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文

致谢