基于DNA纳米结构的功能蛋白调控和生物传感

摘要

蛋白是维持机体正常生命活动不可或缺的生物大分子，它们种类繁多，几乎参与细胞生命周期内的每一个过程，例如分子识别、能量转换、跨膜运输、催化反应等等。可以说，蛋白就是启动生命大厦并保证其持续运转的机械工，蛋白功能紊乱将打破机体运转平衡，导致疾病的发生，因此，探索这些生物大分子的功能机制对人类对抗疾病至关重要。随着分子生物学和分子医学的发展，人们对功能蛋白的研究将不仅仅停留在发现、认知这一层面，实现重要功能蛋白的功能调控和生物传感将有利于人们干预细胞内生命过程以及临床疾病诊疗。一些传统的蛋白调控技术，如基因敲入敲除、RNA干扰技术等直接在基因层面操作，虽然也能实现这一目的，但是缺乏时空精度，不能在分子水平上直接对蛋白进行操作。近年来蓬勃发展的DNA纳米技术可以很好地解决这个问题，因为DNA纳米结构严格遵循“沃森-克里克”碱基互补配对原则(即A-T，C-G)，以一种自下而上的可预测的方式进行组装。依据这一原则我们通过序列匹配的链折叠，几乎可以设计任意形貌的DNA结构。并且基于DNA序列的特异性，这些结构可以为后续修饰提供可寻址的结合位点，这就为我们在分子尺寸上操控一些生物大分子提供了理想的模板和平台。通过对DNA序列进行合理设计和组装，研究人员已经构建出了多种DNA纳米结构用于生物分子组装、调控和传感。为了进一步拓展DNA纳米技术的应用，充分发挥其可编程、可寻址的优势，本论文以功能蛋白的调控和组装为出发点，以DNA纳米结构为调控工具，进行了如下几章研究：　　第2章中，我们构建了一个可控闭合的DNA纳米镊子，并以荧光蛋白为模型研究蛋白间动态相互作用，我们发现，通过合理设计和优化DNA-交联条件，我们可以利用DNA纳米结构人为动态调控蛋白的相对空间位置。第3章中，我们构建了一个DNA立方体盒子(DNA Cage)来特异性激活CRISPRCas12a的反式切割活性，并通过加入不同尺寸的靶标实现了Cas12a反式切割活性的调控。第4章中，我们构建了一种识别、检测一体式的DNA四面体用于端粒酶的活性检测，并通过催化发夹反应(Catalytic Hairpin Reaction, CHA)进行信号放大输出。通过对体系可行性的初步验证，我们发现该探针靶标识别基团和信号报告基团都能对端粒酶以及由端粒产生的二次靶标作出良好的响应。通过以上研究，我们证明了DNA纳米技术在功能蛋白的调控领域和传感领域的确具备巨大的潜力和优势，我们的研究将为后续更深入的探索蛋白功能机制提供新思路。

目录

声明

第1章 绪 论

1.1功能蛋白概述

1.1.1 CRISPR-Cas12a

1.1.2荧光蛋白

1.1.3 端粒酶

1.2 DNA纳米结构

1.2.1 DNA纳米结构的构建

1.2.2 DNA纳米结构的应用

1.3 本文研究思路

第2章 基于DNA纳米镊子的荧光蛋白动态组装

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 荧光蛋白的制备和纯化

2.2.3 DNA纳米镊子的制备

2.2.4 DNA-蛋白交联

2.2.5 凝胶电泳实验

2.2.6 荧光检测实验

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 荧光蛋白的表达与纯化

2.3.3 DNA 纳米镊子的构建与表征

2.3.4 DNA-蛋白交联表征

2.3.5 DNA纳米镊子可控开关对蛋白FRET信号调控

2.3.6 DNA-蛋白交联优化

2.4 小结

第3章 基于DNA 纳米盒子的Cas12a反式切割活性调控新策略

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器与试剂

3.2.2 Cas12a蛋白表达

3.2.3 DNA纳米盒子探针组装

3.2.4 凝胶电泳实验

3.2.5 荧光检测实验

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 Cas12a蛋白表达及活性验证

3.3.3 DNA纳米盒子组装表征

3.3.4 体系可行性验证及Ts链优化

3.3.5 Cage的尺寸选择性讨论

3.3.6体系特异性考察

3.4 小结

第4章 一体式DNA四面体传感平台用于端粒酶检测

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 一体式DNA四面体检测平台的制备

4.2.3 凝胶电泳实验

4.2.4 细胞培养和裂解液的制备

4.2.5 荧光检测实验

4.2.6 酶标仪实时检测实验

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 一体式DNA四面体检测平台的构建与表征

4.3.3 探针可行性初步验证

4.3.4 荧光考察体系可行性

4.3.5 细胞裂解液中端粒酶活性验证

4.6 小结

总结

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢