模拟微重力效应下间充质干细胞成骨分化中的糖代谢变化及作用探究

摘要

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，是成骨细胞的主要来源。太空飞行中宇航员出现的骨质流失现象被认为与在微重力下BMSCs成骨方向分化受到阻碍有关。虽然研究证实微重力可抑制BMSCs的成骨分化，但微重力影响BMSCs成骨分化的相关机制还未被完全阐明。　　糖代谢是细胞新陈代谢的重要内容和细胞功能实现的重要基础，糖代谢的变化与细胞多种生物学行为的改变密切相关。研究发现，BMSCs主要依赖糖酵解(glycolysis)获取能量以维持其增殖与干性，而在分化启动后主要依赖线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)获取大量能量以满足分化所需。目前，微重力效应抑制BMSCs成骨分化过程中细胞糖代谢的变化特征及作用还未见相关报道。鉴于此，本文从代谢的角度探究微重力影响BMSCs成骨分化的分子机制，为深入认识太空微重力环境下宇航员的骨质流失原因提供实验依据。　　本研究利用全骨髓贴壁法从SD大鼠中分离、培养BMSCs，检测BMSCs成骨分化过程中糖代谢情况。利用微重力旋转装置，获得模拟微重力(simulated gravity,SMG)效应，探究SMG效应下BMSCs的成骨分化和糖代谢变化特征。　　结果显示，BMSCs成骨分化过程中糖酵解减弱，OXPHOS增强，组蛋白去乙酰化酶1(sirtuin1,SIRT1)表达增加。在SMG效应下，BMSCs的成骨分化被抑制，糖酵解减弱，OXPHOS减弱，SIRT1表达降低。利用SIRT1激活剂白藜芦醇处理后，常重力和SMG效应下BMSCs成骨分化过程中SIRT1表达均上调。同时，SMG效应下OXPHOS增强，BMSCs成骨分化得到恢复。　　本研究结果证明，SMG效应抑制BMSCs的成骨分化可能是通过抑制SIRT1的表达，减弱OXPHOS导致；通过上调SIRT1表达，增强OXPHOS可有效维持SMG效应下BMSCs的成骨分化。该研究结果提示，SIRT1和OXPHOS可作为BMSCs成骨分化的潜在调控靶点，这为太空微重力效应下骨质流失等相关疾病的预防和治疗提供了理论参考。

目录

英文缩写及中英文对照表

1 绪 论

1.1 研究背景

1.1.1 空间微重力效应下的骨质流失

1.1.2 间充质干细胞与骨生成

1.1.3 模拟微重力效应对间充质干细胞分化的影响

1.1.4 间充质干细胞的分化与糖代谢

1.1.5 间充质干细胞的分化与SIRT1

1.2 问题的提出

1.3.1 研究目的与意义

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

1.4 本文研究的创新点

2 BMSCs 的分离培养与模拟微重力效应装置

2.1 引言

2.2.1 实验动物

2.2.2 实验仪器

2.2.3 实验试剂

2.3 实验方法

2.3.1 原代BMSCs的分离与提取

2.3.2 BMSCs 的培养与传代

2.3.3 BMSCs 的成骨诱导分化

2.3.4 微重力效应模拟装置及工作原理

2.3.5 SMG效应下BMSCs 的成骨诱导分化

2.3.6 碱性磷酸酶活性检测

2.3.7 茜素红S染色

2.3.8 qRT-PCR检测mRNA 表达变化

2.3.9 数据处理与分析

2.4 实验结果

2.4.1 BMSCs 形态学观察

2.4.2 BMSCs 成骨诱导分化结果

2.4.3 SMG效应抑制BMSCs的成骨分化

2.5 讨论

2.6 本章小结

3 SMG 效应下BMSCs 成骨分化过程中糖代谢的变化

3.1引言

3.2.1 实验动物

3.2.2 实验仪器

3.2.3实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 qRT-PCR检测mRNA 表达变化

3.3.2 Western blot 检测蛋白表达变化

3.3.3 mtDNA表达检测

3.3.4线粒体染色

3.3.5耗氧率检测

3.3.6 乳酸产量检测

3.3.7 葡萄糖摄取检测

3.3.8数据处理与分析

3.4.1 BMSCs 成骨分化过程中糖酵解减弱

3.4.2 BMSCs 成骨分化过程中OXPHOS增强

3.4.3 SMG效应下BMSCs 成骨分化过程中糖酵解减弱

3.4.4 SMG效应下BMSCs 成骨分化过程中OXPHOS减弱

3.5 讨论

3.6本章小结

4 SMG 效应影响BMSCs 成骨分化中OXPHOS 变化的分子机理

4.1 引言

4.2.1实验动物

4.2.2实验仪器

4.2.3实验试剂

4.3.1 SMG效应下BMSCs 的成骨分化

4.3.2 白藜芦醇的处理

4.3.3 qRT-PCR检测mRNA 表达变化

4.3.4 碱性磷酸酶活性检测

4.3.5 Western-blot 检测蛋白表达

4.3.6 qRT-PCR检测mtDNA 表达

4.3.7 线粒体染色

4.3.8 耗氧率检测

4.3.9 数据处理与分析

4.4.1 BMSCs 成骨分化中SIRT1 表达上调

4.4.2 SMG效应抑制BMSCs成骨分化中SIRT1 表达

4.4.3 白藜芦醇处理可上调BMSCs 成骨分化中SIRT1的表达

4.4.4 白藜芦醇处理可上调由SMG 效应抑制的SIRT1表达

4.4.5 上调 SIRT1 表达可恢复 BMSCs 成骨分化中由 SMG 效应减弱的OXPHOS

4.4.6 上调SIRT1表达可恢复由SMG效应抑制的BMSCs成骨分化

4.5讨论

4.6本章小结

5 结论与展望

5.1全文总结及结论

5.2存在的不足和后续研究工作展望

参考文献

附 录

A.作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录

B.作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目

C. 学位论文数据集

致谢