转录因子CNC--bZIP家族基因的进化及其成员Nrf1/2差异调控肝癌细胞代谢的机制研究

摘要

长期以来，癌症严重威胁着人类的健康，肝癌作为常见的恶性肿瘤之一，因具有侵袭性强、易转移和预后较差等特点，已成为死亡率较高的癌症。引起肝癌发生的常见因素有乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、黄曲霉素感染和长期过度饮酒等。目前，临床治疗肝癌的方法主要有手术治疗（肝切除术和肝移植）和非手术治疗，非手术治疗包括局部治疗（经导管动脉化疗栓塞术、射频消融、微波消融、经皮无水乙醇注射和放射治疗）、全身药物治疗（系统化疗和生物靶向治疗）和免疫治疗，但均存在预后差和复发的可能。因此，肝癌的发病机制和临床诊治方法一直是科学研究的难点和热点。　　CNC-bZIP家族基因作为bZIP超家族的一个亚类，除了BRLZ（basic region and leucine zipper即bZIP）结构域外，还具有保守的CNC结构域、靠近N端的其他复杂的结构域和保守基序。它由脊椎动物p45Nfe2、Nrf1、Nrf2、Nrf3及其转录抑制因子Bach1、Bach2、果蝇Cnc(cap’n’collar)蛋白和线虫Skn-1(Skinhead-1)蛋白组成。CNC-bZIP转录因子与sMaf蛋白或其他bZIP蛋白形成同源或异源二聚体后，再与靶基因启动子区域的ARE/EpRE元件结合并调控其转录。这些靶基因涉及到多种生物学过程，如抗氧化、细胞增殖、衰老、DNA损伤修复和细胞代谢等。但是，对CNC-bZIP家族基因的进化、尤其早期同源蛋白功能的研究未见报道。另外，尽管Nrf1和Nrf2同属于CNC-bZIP家族的成员，都具有基本的抗氧化功能。然而有研究表明，Nrf1功能缺失的小鼠胚胎，因中胚层形成障碍或贫血而致死，而Nrf2缺失则不发生以上病理表型。这说明Nrf1和Nrf2对胚胎发育的影响存在较大差异。本课题组前期研究也发现，Nrf1α敲除的肝癌细胞迁移、增殖和裸鼠皮下成瘤能力显著增强，而Nrf2敲除的肝癌细胞裸鼠皮下成瘤能力显著减弱。但是，导致这一表型差异的具体分子机制还有待深入研究。　　基于上述背景，本文从进化和癌症代谢的角度出发，通过生物信息学和分子生物学的研究方法，探索CNC-bZIP家族基因的进化、并解析Nrf1和Nrf2在肝癌细胞中的差异性调控机制。结果如下：　　①通过同源搜索和结构搜索相结合的方法，共鉴定到441个bZIP蛋白，它们广泛分布于从病毒、细菌、原生动物到后生动物的23个代表性物种，且bZIP转录因子成员数目随物种从简单到复杂的进化过程逐渐增多。　　②鉴定了CNC-bZIP一个新的亚类，定义为Nach(Nrf and CNC homology)，即Nach1到Nach8。其中，Nach3、5、6和7与人类Nrf1/3一样具有典型的跨膜结构域；而存在于海洋细菌的早期同源蛋白Nach1/2不能在HepG2细胞中单独驱动ARE报告基因的活性，但能负调控Nrf1/2对ARE(antioxidant response element)报告基因的驱动活性，类似于Bach1/2。　　③在人类bZIP蛋白相互作用网络中，Nrf1起着核心的作用，其主要亚型Nrf1α缺失或诱导表达都将引起其他bZIP基因的表达变化。　　④正常培养条件下，Nrf1α?敲除可促进肝癌细胞HepG2糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径、氨基酸合成与转运及脂肪酸积累，减少线粒体氧耗率。反之，Nrf2敲除则抑制HepG2细胞糖酵解、糖异生和氨基酸合成与转运，但不能改变磷酸戊糖途径和引起脂肪沉积。　　⑤葡萄糖缺乏培养下，Nrf1α?敲除的HepG2细胞（Nrf1α-/-）表现出快速的非凋亡形式的细胞死亡，即培养12h就能观察到明显的细胞死亡现象。然而，Nrf2敲除的HepG2细胞（Nrf2-/-）则能一定程度抵抗葡糖缺乏引起的细胞死亡，即培养24h细胞仍然生长良好。　　⑥葡萄糖缺乏培养下，Nrf1α?敲除的HepG2细胞快速死亡，是由破坏的抗氧化系统、异常的葡萄糖和能量代谢、以及受阻的丝氨酸转谷胱甘肽合成途径介导。　　以上研究结果表明：一方面，CNC-bZIP家族基因早期同源蛋白存在于海洋细菌中，可作为人类Nrf1/2的负调控因子,类似于Bach1/2；另一方面，Nrf1和Nrf2在肝癌细胞代谢重编程中起着差异性调控作用。值得强调的是，Nrf1α-/-细胞对葡萄糖缺乏非常敏感，因此，葡萄糖饥饿疗法可能成为Nrf1缺陷型癌症预防和治疗的一种有效策略。

目录

英文缩写一览表

1 绪论

1.1 立题依据

1.2.1 癌症十大特征

1.2.2 癌症细胞葡萄糖代谢

1.2.3 癌症细胞氨基酸代谢

1.2.4 癌症细胞脂质代谢

1.2.5 bZIP转录因子概述

1.2.6 CNC-bZIP转录因子概述

1.2.7 Nrf1转录因子研究进展

1.2.8 Nrf2转录因子研究进展

1.2.9 Nrf1/2的差异性研究进展

1.3.1 研究内容

1.3.2 技术路线

2 人类CNC-bZIP 家族基因的系统进化分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 数据库和基因序列

2.2.2 分析工具和软件

2.2.3 生物信息学分析方法

2.3 结果与分析

2.3.1 bZIP转录因子的物种分布和系统进化分析

2.3.2 人类 bZIP转录因子家族基因的染色体分布

2.3.3 人类 bZIP蛋白质保守结构域分析

2.3.4 人类 bZIP转录因子家族基因的 GO功能注释

2.3.5 人类 bZIP转录因子家族基因在进化过程中的选择压力分析

2.3.6 人类 CNC-bZIP 亚家族基因的系统进化分析

2.4 总结与讨论

3 CNC-bZIP 家族成员Nach1/2蛋白的功能探究

3.1 引言

3.2.1 分析软件

3.2.2 实验材料

3.2.3 实验试剂和溶液

3.2.4 主要实验仪器

3.2.5 实验方法与步骤

3.3.1 人类 bZIP家族基因系统进化分析

3.3.2 人类 bZIP家族成员间相互调控网络及差异性表达

3.3.3 CNC-bZIP家族早期同源蛋白 Nach1/2结构域分析

3.3.4 CNC-bZIP家族早期同源蛋白 Nach1/2的差异性功能

3.4 总结与讨论

4 Nrf1 和Nrf2 差异性调控肝癌细胞代谢重编程

4.1 引言

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验试剂与溶液

4.2.3主要实验仪器

4.2.4 实验方法与步骤

4.3 结果与分析

4.3.1 Nrf1和 Nrf2差异性调控 HepG2细胞糖酵解途径

4.3.2 Nrf1和 Nrf2差异性调控 HepG2细胞磷酸戊糖途径和糖异生途径

4.3.3 Nrf1和 Nrf2差异性调控 HepG2细胞三羧酸循环途径

4.3.4 Nrf1和 Nrf2差异性调控 HepG2细胞脂质代谢

4.3.5 Nrf1和 Nrf2差异性调控 HepG2细胞氨基酸合成与转运

4.3.6 Nrf1α 敲除导致的丝氨酸合成及糖代谢途径变化是否真正由 Nrf1介导

4.4 总结与讨论

5 葡萄糖饥饿导致Nrf1α 敲除的HepG2 细胞快速死亡

5.1 引言

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验试剂与溶液

5.2.3主要实验仪器

5.2.4 实验方法与步骤

5.3 结果与分析

5.3.1 葡萄糖缺乏导致 Nrf1α-/-细胞快速死亡

5.3.2 凋亡抑制剂不能阻止葡萄糖缺乏导致 Nrf1α-/-细胞快速死亡

5.3.3 果糖和甘露糖可代替葡萄糖阻止 Nrf1α-/-细胞死亡

5.3.4 2-脱氧葡萄糖可缓解葡萄糖缺乏导致的 Nrf1α-/-细胞死亡

5.3.5 NAC和 Catalase可有效阻止葡萄糖缺乏导致 Nrf1α-/-细胞死亡

5.3.6 干扰 Nrf2可减轻葡萄糖缺乏导致的 Nrf1α-/-细胞死亡

5.4 总结与讨论

6 葡萄糖饥饿导致 Nrf1α敲除的HepG2细胞快速死亡的机制研究

6.1 引言

6.2.1 实验材料

6.2.2 实验试剂与溶液

6.2.3主要实验仪器

6.2.4 实验方法与步骤

6.3 结果与分析

6.3.1 葡萄糖剥夺下 Nrf1α-/-细胞死亡由破坏的抗氧化系统介导

6.3.2葡萄糖剥夺下 Nrf1α-/-细胞能量代谢异常

6.3.3 葡萄糖剥夺下 Nrf1α-/-细胞糖代谢异常

6.3.4 葡萄糖剥夺抑制了 Nrf1α-/-细胞丝氨酸转谷胱甘肽合成途径

6.3.5 葡萄糖缺乏下 Nrf1和 Nrf2差异性介导氧化还原代谢重编程

6.4 总结与讨论

7 结论与展望

7.1 全文总结

7.2 未来展望

参考文献

附录

A．作者在攻读博士学位期间发表的论 文

B．作者在攻读博士学位期间 参与的科研项目

C. 学位论文数据集

致谢