模拟三维生化微环境中癌细胞的增殖--侵袭转变

摘要

乳腺癌转移是一个复杂的过程，受多种因素影响，包括各种细胞间相互作用，与组织微环境的耦合，生化梯度的影响，这些都与乳房组织的复杂结构和组成密切相关。本研究构建了一个高通量的体外生物芯片，其中包含642个微腔室的阵列，每个腔室通过由胶原蛋白和基质凝胶组成的细胞外基质（ECM）模拟三维生化微环境，此外，在芯片的四个边界处施加所需的营养物或药物，可以在芯片中获得复杂的四方浓度梯度分布，从而在微腔阵列中产生明显的局部营养物或药物梯度。此芯片中的微腔阵列和模拟的细胞外基质，旨在研究乳腺上皮细胞和定向胶原纤维对转移性乳腺癌细胞侵袭的影响。结果表明，盘状结构域受体酪氨酸激酶1（DDR1）抑制剂7rh和基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂batimastat对上皮细胞MCF-10A的生长和迁移没有明显影响，而对转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231的DDR1表达和迁移行为有明显的抑制作用。7rh和batimastat抑制剂对MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用呈剂量依赖性。此芯片的设计不仅能够为研究癌症侵袭机制构建更现实的体外模型，而且可以发展成为下一代高通量和治疗性筛选(如ECM重建抗癌药物评价)的平台，具有较高的发展潜力。　　主要工作包括以下五个方面：　　(1)微流控芯片的制作：采用软刻蚀技术以及表面等离子体键合技术等，制作了符合实验要求的PDMS微流控芯片。利用复合凝胶和印章的方形阵列图案形成微腔基质微环境。分别种入乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞，完成乳腺导管原位癌模型。　　(2)表征复合凝胶：扫描电子显微镜（SEM）成像分析胶原蛋白与基质胶组成的复合凝胶的优势。二值化处理和COMSOL Multiphysics软件模拟分析胶原纤维取向与微腔结构的关系。　　(3)复杂梯度的动态模拟：利用FITC-Dextran（绿色）、Rhodamine-Dextran（红色）、Cascade blue-Dextran（蓝色）荧光分子和1×PBS模拟浓度梯度随时间的演变过程。　　(4)微腔阵列中细胞的动态发展分析：用ImageJ、MATLAB、Microsoft Excel和Origin等软件分别分析微腔阵列中乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MDA-MB-231和微腔外乳腺癌细胞MDA-MB-231off chamber的荧光强度分布和关联。　　(5)细胞免疫荧光分析：用免疫荧光技术标记盘状结构域受体酪氨酸激酶1DDR1与E-钙粘蛋白E-cadherin分析复杂药物梯度下系统中细胞间及细胞与微环境间的相互作用。

目录

1 绪 论

1.1 问题的提出及研究的意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1物理学领域研究癌症的国内外现状

1.2.2构建三维培养模型的国内外研究现状

1.2.3基于微流控芯片构建复杂梯度的国内外研究现状

1.2.4癌症中取向性胶原纤维研究的国内外现状

1.3.1研究目的

1.3.2研究内容

2 三维乳腺癌模型的建立

2.1 引言

2.2.1微流控芯片的设计

2.2.2实验材料与设备

2.2.3 PDMS微流控芯片的制作

2.3.1实验准备

2.3.2 乳腺导管癌模型的生成

2.4 结果与讨论

3 模拟基质微环境的复合凝胶的表征

3.1 引言

3.2 复合凝胶的制备

3.3 基于SEM成像的分析

3.3.1 SEM成像

3.3.2 MATLAB二值化处理及统计分析

3.4.1 MATLAB二值化处理

3.4.2 COMSOL模拟微腔间应力

3.5 结果与讨论

4 复合梯度的动态模拟

4.1 引言

4.2.1 实验材料

4.2.2 制备流程

4.3 结果与讨论

5 微腔阵列中细胞的动态发展和免疫荧光分析

5.1 引言

5.2 微腔阵列中细胞分布的定量分析

5.2.1 细胞荧光强度分布随时间的演变过程

5.2.2 微腔阵列中局部荧光强度的定量分析

5.3.1 微腔阵列中细胞间相关性分析

5.3.2 复杂生化梯度下细胞分布的理论模拟

5.4 微腔阵列中细胞的免疫荧光分析

5.4.1 免疫荧光技术

5.4.2 DDR1和E-cad蛋白表达分析

5.5 结果与讨论

6 总结与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

A. 在研究生学习期间的研究成果

B. 学位论文数据集

致谢