利用DNA洗牌技术构建GRATEN体系用于基因组编辑的研究

摘要

基因突变一直是研究基因功能的最有效方法。随着现代基因组测序技术的迅速发展，大量的基因或其调控因子功能需要鉴定。因此建立精确、高效的基因组定点突变技术，运用反向遗传学方法研究基因（或 DNA）的功能是当前功能基因组学研究的热点之一。人工介导的锌指核酸酶技术（ZFN）、类转录激活因子样效应物核酸酶技术（TALEN）和RNA介导的规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统都可以精确地在基因组的特定位点上产生DNA双链切口，进而经细胞内源性修复机制（同源重组修复或非同源末端连接）的修复而实现基因插入、缺失和碱基替换等突变。与传统的基因组编辑技术相比，基因编辑新技术不仅保留了可定点修饰的特点，还可应用到更多的物种上，大大提高了基因定点突变效率，其载体的构建时间缩短，成本降低，为实现基因组定点突变提供广阔的平台。然而，最近的研究发现，CRISPR系统脱靶率非常高。　　本研究利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因，并实现一次性定点突变二个氨基酸位点。利用DNA洗牌技术构建了表达载体，首次在植物中利用引导 RNA偶联核酸内切酶(guided RNA and tethered endonuclease，GRATEN)用于基因组编辑，研究GRATEN系统介导的基因组编辑技术在植物基因组中定点突变的可能性。在烟草叶片中瞬时表达，并进行了致突变的初步研究。　　GRATEN系统包含蛋白质和RNA二部分，将二组分克隆到同一植物表达载体。蛋白质组分包含来自于噬菌体MS2外壳蛋白（MS2 coat protein，MCP）和核酸内切酶FokI的切割结构域，MCP的N和C端分别融合FokI，表达后形成FokI:MCP:FokI融合蛋白。RNA组分包含串联的指导RNA（guided RNA，gRNA）和MCP结合RNA。gRNA与目标DNA通过碱基配对而识别并结合到靶DNA，MCP以二聚体的形式与形成特定二级结构的RNA结合，由此在靶DNA特定位点形成FokI二聚体，切割DNA，产生双链断裂，经细胞内修复机制（主要为非末端连接，Non-Homologous End Joining，NHEJ）产生碱基替换、缺失和插入等突变。　　利用GRATEN系统，我们选择本氏烟草（Nicotiana benthamiana）八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）基因作为打靶基因。结果显示可产生较高（约35.7％）基因突变率。我们的研究结果初步说明GRATEN系统可用于植物（有可能在其他生物）基因组定点突变，为功能基因组研究、基因治疗等提供了一种新的设计思路和技术。

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前言

第一章 绪论

1.1 基因组编辑技术

1.2 锌指核酸酶技术

1.3 类转录激活因子样效应物（TALEs）核酸酶技术：

1.4 基于CRISPR/Cas系统的RNA介导的基因组编辑技术

1.5 GRATEN系统

1.6 DNA洗牌技术

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 构建基因打靶载体

2.4 植物瞬时表达载体

2.5 突变基因的筛选

第三章 结果与分析

3.1 打靶载体的构建

3.2 植物瞬时表达基因

3.3 基因突变的检测与筛选

第四章 讨论与展望

4.1 GRATEN技术

4.2 利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因简便、通用、高效

4.3 展望

参考文献

附录

缩略语表

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文