雷公藤红素对NETs相关因子的剂量效应及一种新吞噬功能检测法初探

摘要

目的:　　观察雷公藤红素对人中性粒细胞mTOR mRNA的表达及组蛋白H3释放的影响，并探讨、分析两者间关系，探讨雷公藤红素对中性粒细胞组蛋白H3释放可能存在的剂量效应，及其对中性粒细胞抗感染功能影响，进而为雷公藤在临床运用上提供基础实验结果和理论依据。建立一种新的评价中性粒细胞吞噬功能的流式细胞仪-石墨烯量子点方法，经过优化将其初步运用于评价健康人和肿瘤化疗后患者中性粒细胞吞噬功能。　　方法:　　1.雷公藤红素对中性粒细胞mTOR表达及组蛋白H3释放的影响　　分离健康人外周血中性粒细胞，短暂培养。雷公藤红素分别按低剂量、中剂量、高剂量三组各干预中性粒细胞1h、1.5h、2h，运用Real-time PCR检测mTOR mRNA表达，同时平行采用激光共聚焦荧光显微镜检测中性粒细胞组蛋白H3的释放情况，并分析两者间关系。　　2.一种新型荧光材料GQDs评价中性粒细胞吞噬功能的流式细胞术方法初探　　应用透射电子显微镜观察中性粒细胞吞噬石墨烯量子点情况，进而采用激光共聚焦荧光显微镜观察被吞入中性粒细胞内的石墨烯量子点的荧光特性。对实验条件进行优化，同时使用QuantiBRITE PE标准微球对石墨烯量子点荧光强度进行标准化处理，建立一种新的评价中性粒细胞吞噬功能的流式细胞仪-氧化石墨烯量子点方法;并将此法用于评价健康成人和肿瘤化疗后患者中性粒细胞的吞噬功能，初步验证其可行性。　　结果:　　1.雷公藤红素对中性粒细胞mTOR mRNA表达的剂量效应　　实验研究结果显示，雷公藤红素在低浓度短时间内可诱导mTOR mRNA表达增加，但随着干预浓度及时间的延长，mTOR mRNA的表达受到显著的抑制。　　2.雷公藤红素对佛波酯刺激中性粒细胞释放组蛋白H3的剂量效应　　低浓度雷公藤红素在短时间内能够抑制佛波酯刺激中性粒细胞释放组蛋白H3，高浓度能促进佛波酯刺激中性粒细胞释放组蛋白H3。雷公藤干预中性粒细胞1小时后，在佛波酯的刺激下，高浓度组(4.0μM)比对照组(0.0μM)能够释放更多量的组蛋白H3，而低浓度(1.0μM)干预1小时时，在佛波酯的刺激下未能释放组蛋白H3。　　3.透射电子显微镜观察显示石墨烯量子点被大量吞入中性粒细胞胞内，在中性粒细胞的吞噬囊泡和伪足内可见密集的石墨烯量子点，与空白对照比较，无非特异性吸附。　　4.激光共聚焦荧光显微镜观察显示被吞入中性粒细胞胞内的石墨烯量子点在同一激发光激发下发射不同波长荧光，当发射波长为408nm呈现明显蓝色，发射波长为488nm呈现明显绿色。　　5.初步建立一种新的评价中性粒细胞吞噬功能的流式细胞仪-石墨烯量子点方法　　初步确定实验优化条件:200μl的全血，加入10μl脂多糖(LPS100ng/ml)，12μlGQDs，37℃水浴反应30min。使用QuantiBRITE PE标准微球对石墨烯量子点荧光强度进行标准化处理;并将本方法用于评价健康成人和肿瘤化疗后患者中性粒细胞的吞噬功能，结果显示该法能明显区分化疗组患者和健康组的中性粒细胞吞噬功能(P＜0.05)。　　结论:　　1.雷公藤红素对人中性粒细胞mTOR mRNA表达和组蛋白H3释放呈现剂量效应。　　2.初步建立了评价中性粒细胞吞噬功能的流式细胞仪-石墨烯量子点方法。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 雷公藤红素对中性粒细胞mTOR的表达及组蛋白H3释放的影响

1 实验材料

1．1 实验对象

1．2 主要试剂和耗材

1．3 主要仪器设备

1．4 主要试剂的配置

2 实验方法

2．1 标本采集

2．2 外周血中性粒细胞分离及鉴定

2．3 分组及干预

2．4 实时荧光定量PCR

2．5 雷公藤红素对中性粒细胞组蛋白H3释放的影响

3 统计学处理

4 实验结果

4．1 外周血中性粒细胞分离及鉴定

4．2 雷公藤红素对人中性粒细胞mTOR mRNA表达的剂量效应

4．3 低浓度雷公藤红素在短时间内能够抑制PMA刺激PMN释放组蛋白

4．4 雷公藤红素能促进PMA诱导PMN释放组蛋白

5 讨论

第二部分 一种新型荧光材料GQDs评价PMN吞噬功能的流式细胞术方法初探

1 实验材料

1．1 实验对象

1．2 主要试剂和耗材

1．3 主要仪器设备

1．4 实验试剂的配置

2 实验方法

2．1 透射电子显微镜观察中性粒细胞对石墨烯量子点吞噬情况

2．2 激光共聚焦荧光显微镜观察粒细胞对石墨烯量子点吞噬情况

2．3 石墨烯量子点评价中性粒细胞吞噬功能反应条件优化

2．4 采用QuantiBRITE PE标准微球对石墨烯量子点荧光强度进行标准化处理

2．5 石墨烯量子点评价中性粒细胞吞噬功能的初步应用

3 统计学处理

4．1 透射电子显微镜观察PMN吞噬GQDs情况

4．2 激光共聚焦荧光显微镜下石墨烯量子点被吞噬情况

4．3 流式细胞仪设门分析PMN

4．4 GQDs检测PMN吞噬功能的流式细胞术反应条件优化

4．5 化疗后患者PMN吞噬GQDs较健康人降低

5 讨论

5．1 GQDs能被PMN有效摄入胞内并保持荧光特性

5．2 基于流式细胞术建立石墨烯量子点评价中性粒细胞吞噬功能的方法

6 结论

参考文献

附录

致谢

文献综述

作者简历