石蒜花色苷合成相关基因的克隆、表达及表达载体的构建

摘要

石蒜属植物是广泛分布于我国的一种优良的球根类观赏植物，现已应用于鲜切花、地被绿化、园林景观配置等方面。本研究以石蒜花瓣为材料，克隆了花色素苷生物合成途径中的关键酶基因，并对其时空表达模式进行分析，同时构建了其中3个基因的植物表达载体，以期为今后研究石蒜花色形成的分子机理以及利用基因工程技术选育花色新品种奠定基础;主要研究成果如下：　　 ⑴采用同源克隆结合RACE技术的方法，获得了花色素苷生物合成途径中LrCHI、LrFLS、LrF3H、LrDFR和LrANS5个结构基因的cDNA全长序列，分别为948 bp、1360 bp、1293 bp、1338 bp和1292 bp，分别编码236、333、365、364和355个氨基酸。利用NCBI的Blastn和Blastp工具进行比对分析显示，5个结构基因与其它已知植物的相关基因均具有较高的同源性。运用生物信息学分析软件对5个结构基因的分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域、二级结构及保守结构域等进行了分析，同时在多序列比对的基础上构建了其系统进化树。系统进化树分析表明，5个基因的系统进化基本符合植物分类学分类，且具有较明显的种属特性。　　 ⑵利用荧光实时定量RT-PCR技术对石蒜花色素苷生物合成途径中的关键基因LrCHI、LrFLS、LrF3H、LrDFR和LrANS在不同花发育时期及不同器官中的表达模式进行了分析。结果表明，LrCHI和LrDFR在花发育的前几个时期表达量较高;LrF3H基因和LrANS基因的表达量都是随着花的开放逐渐增加，而后随着花的萎蔫表达量又下降;只有LrFLS基因在凋谢期花瓣中的表达量最高，而在其它时期的表达量相对较低。在不同器官中的表达分析表明LrCHI和LrFLS表达特征相似，即在叶、花葶及花瓣中表达量较高，而在根和鳞茎中表达量相对较低;LrF3H、LrDFR和LrANS基因都是在根、鳞茎和叶中表达量较低，而在花葶和花瓣中表达量相对较高。　　 ⑶为进一步研究LrF3H、LrDFR和LrANS基因的功能，分别将3个基因连接到含有35S组成型启动子的植物表达载体pCAMBIA13011上，成功构建植物过表达载体pCAMBIA13011-LrF3H、pCAMBIA13011-LrDFR和pCAMBIA13011-LrANS。同时，将以上重组质粒转化根癌农杆菌EHA105，成功构建了农杆菌工程菌。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 花色形成概述

1．1．1 花瓣的组织结构与花色形成

1．1．2 植物色素的种类

1．1．3 花色素与花色形成

1．2 花色素苷的合成途径及相关基因的研究

1．2．1 花色素苷的合成途径

1．2．2 花色素苷合成相关的结构基因与调节基因的克隆

1．3 植物基因克隆技术的研究

1．3．1 根据已知基因的序列克隆植物基因

1．3．2 利用植物基因的蛋白质产物克隆基因

1．3．3 基因标签法

1．3．4 cDNA末端快速扩增法

1．4 花色基因工程在植物花色育种上的应用

1．5 石蒜属植物的研究概况

1．6 存在的问题与展望

1．6．1 影响花色的其他因素

1．6．2 花色基因工程的不足

1．7 本研究的目的与意义

第二章 石蒜花色素苷生物合成相关基因的克隆及序列分析

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与载体

2．1．3 主要试剂与试剂盒

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 石蒜总RNA的提取与检测

2．2．2 石蒜CHI、FLS、F3H、DFR和ANS基因中间片段的克隆

2．2．3 石蒜CHI、FLS、F3H、DFR和ANS基因的3’RACE及5’RACE扩增

2．2．4 石蒜CHI、FLS、F3H、DFR和ANS基因cDNA全长序列的验证

2．2．5 石蒜CHI、FLS、F3H、DFR和ANS基因的生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 石蒜总RNA的提取

2．3．2 石蒜CHI、FLS、F3H、DFR和ANS基因的克隆

2．3．3 石蒜CHI、FLS、F3H、DFR和ANS基因的生物信息学分析

2．4 讨论

第三章 石蒜花色素苷生物合成相关基因的表达分析

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 主要试剂与试剂盒

3．2 方法

3．2．1 石蒜总RNA的提取

3．2．2 cDNA的合成

3．2．3 实时荧光定量RT-PCR

3．3 结果与分析

3．3．1 石蒜花色素苷合成相关基因在不同花发育时期的表达分析

3．3．2 石蒜花色素苷合成相关基因的器官特异性表达分析

3．4 讨论

第四章 LrF3H、LrDFR和LrANS基因植物表达载体的构建

4．1 试验材料

4．1．1 菌株与载体

4．1．2 主要试剂与试剂盒

4．1．3 主要仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 附有酶切位点的LrF3H、LrDFR和LrANS基因的全长扩增

4．2．2 植物表达载体的构建

4．2．3 农杆菌工程菌的构建

4．3 结果与分析

4．3．1 附有酶切位点的LrF3H、LrDFR和LrANS基因的全长扩增

4．3．2 植物表达载体的构建

4．3．3 农杆菌工程菌的构建

4．4 讨论

第五章 结论

5．1 主要研究成果

5．2 今后研究的方向与目标

参考文献

附录

个人简介

致谢