基于高内涵筛选的通脉养心丸抗心肌肥大与抗纤维化药效物质研究

摘要

传统中药是中华民族的传统瑰宝，经近几千年的临床实践证明了中医药在防病治病方面发挥了其独特优势。然而，大部分中药尤其是复方中药治疗疾病的药效物质尚不明确。为了诠释传统中医药理论的科学内涵，保障药物质量，如何发现中药药效物质是中医药现代研究中亟待解决的关键科技问题，而构建高通量、准确特异的中药药效物质筛选方法是破解这一难题的重要途径。　　目的：　　本论文在整体和离体水平上开展了较深入研究，以通脉养心丸为研究对象，首先在整体动物模型上发现其具有抗心力衰竭作用，并对其作用机制进行初步探讨；采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌细胞（H9c2）构建心肌肥大模型，观察通脉养心丸的抗心肌肥大作用；采用转化生长因子-β（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）构建纤维化模型，观察通脉养心丸的抗纤维化作用。建立了两种基于双重荧光标记的高内涵筛选方法，筛选发现通脉养心丸抗心肌肥大和抗纤维化的药效物质。　　方法：　　1.采用异丙肾上腺素（ISO）诱导C57BL/6小鼠2周构建心力衰竭模型，经超声心动检测，选取造模成功的小鼠随机分成模型组和给药组，通脉养心丸以2.0g/kg的剂量灌胃给药2周，给药结束后，各组小鼠进行超声心动检测，通过检测给药前后小鼠心功能、心脏结构以及病理组织学的变化，确证通脉养心丸的抗心力衰竭作用。利用Western-blot、PCR技术对通脉养心丸抗心力衰竭可能的作用机制进行研究。　　2.采用AngⅡ诱导H9c2心肌细胞48h构建心肌细胞肥大模型。首先确认通脉养心丸的抗心肌肥大作用，在活性导向下，建立基于双重荧光标记的高内涵筛选方法，筛选通脉养心丸中具有抗心肌肥大活性的药效物质。以鬼笔环肽标记激动蛋白（F-actin）， Hochest标记细胞核进行双重荧光标记，通过心肌细胞面积的变化进行表型筛选。通脉养心丸经制备所得组分应用于筛选模型进行第一次筛选，通过液质联用方法对活性组分进行鉴定，推断其中的化合物；将潜在的活性化合物应用于筛选模型进行第二次筛选，从而发现抗心肌肥大的药效物质；并应用Western-blot技术对筛选得到的化合物可能的作用机制进行探究。　　3.采用转换生长因子（TGF-β1）刺激人肾小管上皮细胞（HK-2）构建纤维化模型。首先确认通脉养心丸的抗纤维化作用，在活性导向下，建立基于双重荧光标记的高内涵筛选方法，进行抗纤维化药效物质研究。以α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）荧光标记细胞形态，Hochest标记细胞核，根据α-SMA荧光强度的变化进行表型筛选。通脉养心丸经制备所得组分应用于筛选模型进行第一次筛选，通过液质联用方法对活性组分进行鉴定，推断其中的化合物；将潜在的活性化合物应用于筛选模型进行第二次筛选，从而发现抗纤维化的药效物质。　　结果：　　1.超声心动结果显示，与正常组相比，ISO诱导2周的C57BL/6小鼠模型组中，心功能指数 EF%、FS%显著降低，左室后壁厚度（LVPW）变薄，左心室内径（LVID,d；LVID,s）与左室容积（LV Vol,d；LV Vol,s）明显增大，提示成功建立了心力衰竭模型。通脉养心丸灌胃给药2周，可明显恢复小鼠心脏功能，改善心脏结构，证实了通脉养心丸具有抗心力衰竭作用。心脏组织病理学结果显示，通脉养心丸能抑制胶原形成。利用Western-blot技术对 Collagen-Ⅰ的表达水平进行测定，发现通脉养心丸能显著下调Collagen-Ⅰ的表达。Western-blot与PCR结果显示，模型组中Sirt3的表达显著下调，给予通脉养心丸后，Sirt3表达明显回调，证明激动Sirt3为通脉养心丸抗心力衰竭作用途径之一。　　2.从通脉养心丸中筛选出5个组分具有抗心肌肥大活性；经第二次筛选，发现来源于通脉养心丸方中君药甘草药材的甘草利酮、甘草异黄酮A、粗毛甘草素A以及来源于臣药何首乌药材中的大黄素具有抗心肌肥大活性。研究发现，甘草异黄酮A能上调Sirt3蛋白的表达，证明激动Sirt3为甘草异黄酮A抗心肌肥大作用途径之一。　　3.从通脉养心丸中筛选出5个组分具有抗纤维化活性；经第二次筛选，发现来源于通脉养心丸方中君药甘草药材中的甘草酸、粗毛甘草素A、甘草异黄烷甲具有抗纤维化活性。　　综上所述，在整体动物模型上验证了通脉养心丸具有显著的抗心力衰竭作用，且证明了激动Sirt3为通脉养心丸抗心力衰竭作用途径之一。　　在离体水平上筛选发现通脉养心丸方中君药甘草药材中的甘草异黄酮A、甘草异黄烷甲、粗毛甘草素A以及臣药何首乌药材中的大黄素具有抗心肌肥大活性；甘草中的甘草酸、甘草异黄烷甲、粗毛甘草素A具有抗纤维化活性；并从抗心肌肥大的活性化合物中发现一个化合物为 Sirt3激动剂，为深入了解通脉养心丸治疗心血管疾病的作用机制提供新的科学依据。

目录

声明

英文缩略词

前言

实验一 通脉养心丸抗异丙肾上腺素致小鼠心力衰竭作用及机制研究

1 实验材料与方法

2 实验结果

3 小结

实验二 基于高内涵筛选的通脉养心丸抗心肌肥大药效物质研究

1 实验材料与方法

2 实验结果

3 小结

实验三 基于高内涵筛选的通脉养心丸抗纤维化药效物质研究

1 实验材料与方法

2 实验结果

3 小结

讨论

3. 通脉养心丸抗心肌肥大活性成分探讨

4. 通脉养心丸抗纤维化活性成分探讨

结论

创新点

总结与展望

参考文献

综述:心肌肥大与纤维化的研究进展

致谢

个人简历