幽门螺杆菌临床株分离及东亚与西方型菌株比较分析

摘要

目的：分离鉴定幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)临床株，分析其细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxinassociated gene A protein, CagA)磷酸化基序EPIYA的结构特点，比较H.pylori东亚株和西方株CagA蛋白的结构差异，初步探讨东亚型和西方型CagA对细胞增殖与凋亡的影响。　　方法:选取胃相关疾病患者的胃黏膜组织，剪碎后接种于哥伦比亚血琼脂平板，微需氧培养，菌落生长后通过尿素酶试验、革兰染色及显微镜检查对H.pylori进行初步鉴定。提取菌落基因组，PCR扩增H.pylori16S rRNA基因并进行测序鉴定；扩增cagA基因全长序列，连接入 pMD18-T载体，将重组载体转入感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α，挑起阳性克隆，测序鉴定；利用DNAStarV7.1和MEGA6软件对cagA序列进行比对及聚类分析。应用多个生物数据库和多种生物学软件对 H. pylori CagA蛋白进行信息学分析；将东亚、西方型全长cagA基因定向克隆入pcDNA3.1真核表达载体，获得的阳性克隆测序鉴定后转染胃癌细胞株MKN-45，通过流式细胞术检测CagA对细胞增殖和凋亡的影响。　　结果：成功分离H.pylori临床株共26株；构建pMD18-T/cagA克隆载体后对26株H.pylori的cagA基因全长测序，序列比对分析显示有6株为西方型，20株为东亚型。东亚型CagA第815~834位点存在13个氨基酸的缺失、部分缺失或变异，西方型中有3株丢失磷酸化位点EPIYA-C；聚类分析显示H.pylori分离株分别聚类为东亚群、西方型东亚群以及西方群3群，与东亚国家日本菌株的同源性最高，共同聚类于东亚群。选取CagA/GZ7（典型东亚株）和CagA/26695（典型西方株）进行理化特性分析和空间构像预测，结果显示 CagA/26695有1184个氨基酸，分子量为132.36kDa，等电点为8.93；CagA/GZ7有1175个氨基酸，分子量为131.32kDa，等电点为8.30；两种菌株的CagA蛋白空间结构较为相似，均为亲水性的稳定蛋白，位于胞质内，但其抗原肽段的位置、二级结构的组成及保守结构域在东亚型和西方型CagA之间存在差异。与对照组pcDNA3.1细胞比较，高表达cagA的细胞：pcagA/26695细胞组和 pcagA/GZ7细胞组的凋亡百分率分别为8.29±0.61和9.98±1.07，均高于对照组细胞（5.38±0.61），差异有统计学意义（均P<0.01）；虽然pcagA/GZ7细胞组的凋亡率稍高于pcagA/26695细胞组，但差异无统计学意义（P>0.05）。细胞周期结果显示：pcagA/26695细胞组和 pcagA/GZ7细胞组G0-G1期细胞百分率均高于pcDNA3.1细胞组（百分率分别为36.14〒3.16，36.56〒1.62和30.88〒1.03），差异有统计学意义（P<0.05）；S期细胞均显著低于pcDNA3.1细胞组（百分率分别为48.57〒2.90，48.01〒2.22和54.57〒1.52，P<0.05），而G2-M期细胞百分率在三组之间差异无统计学意义（百分率分别为15.29〒0.43，15.42〒0.59和14.55〒0.88，P>0.05），各细胞周期的百分率在pcagA/26695细胞组和pcagA/GZ7细胞组之间也无显著差异。　　结论：H.pylori临床分离株以东亚株为主，但也存在西方株感染；东亚型和西方型CagA存在结构差异；临床分离株之间存在聚类关系，与日本株同源性较高；生物信息学预测东、西方型CagA在二级结构和保守结构域存在一定差异；CagA可抑制胃癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，但东亚型与西方型CagA之间无显著差异。

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英文缩略词表

0 引言

1 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2结果

2.1 H.pylori菌株鉴定

2.2 cagA全长基因载体构建及序列测定

2.3 CagA蛋白全长序列分析

2.4 CagA序列聚类分析

2.5东、西方菌株中CagA组成分析及结构预测

2.6 cagA基因真核表达载体的构建及鉴定

2.7 pcagA/26695与pcagA/GZ7转染细胞后凋亡检测

2.8 pcagA/26695细胞与pcagA/GZ7转染细胞后周期分析

3讨论

5 结论

参考文献

综述：幽门螺杆菌重要的毒力因子和效应因子

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致谢

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