家蚕促咽侧体素受体鉴定及相关神经肽受体基因的发育表达

摘要

昆虫神经肽及其G蛋白偶联受体(GPCR)在调控其生长、发育、生殖、神经传导、代谢以及行为等方面起重要的作用，是绿色农药设计重要的靶基因。促咽侧体素是家蚕重要神经肽，其主要的生理功能是促进保幼激素的合成和分泌，加速心脏搏动，抑制活性离子运输等。把昆虫促咽侧体素的受体作为靶基因研究高活性的昆虫生长调节剂具有重要的意义。本文克隆并鉴定了家蚕神经肽促咽侧体素的G蛋白偶联受体基因(Allatotropin receptor，Bom-ATR)，调查其发育变化；然后系统地研究了家蚕其他16种相关的神经肽受体基因的发育表达模式。
　　家蚕促咽侧体素受体基因开放阅读框全长为1254bp，编码416个氨基酸。Bom-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白，符合GPCR家族成员的典型特征。预测家蚕ATR的3-D结构结果表明其包含18个螺旋，其中主要的α-螺旋有7个，与7次跨膜结构一致。家蚕的ATR与烟草天蛾的ATR关系最接近，其次为家蚕神经肽受体BNGR-5，家蚕的ATR与埃及伊蚊、小金蜂、赤拟谷盗的ATR距离较远，这与传统的系统关系一致。把Bom-ATR的ORF插入到pcDNA5-FRT质粒中，构建pcDNA5-FRT-Bom-ATR-ORF重组质粒，转染HEK细胞株，与家蚕AT结合分析表明，AT与Bom-ATR结合Ca2+产生明显的应答，Ca2+的响应曲线呈现出剂量依赖型，AT与Bom-ATR作用的EC50值为2.16nM，证明克隆的Bom-ATR是AT的G蛋白偶联受体。
　　实时荧光定量PCR结果表明，家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高，其次为蛹后期，蛹前期和成虫阶段表达量最低。其中5龄幼虫第2天表达量最高，5龄1-5天持续维持较高的表达水平，这可能与保幼激素的合成有关。
　　调查了其他15种神经肽G蛋白偶联受体基因在家蚕脑-咽下神经节复合体中的发育表达模式，不同神经肽G蛋白偶联受体基因发育表达模式明显有差别。所调查的16种神经肽基因中，sNPF1等7个受体基因在5龄前期表达量高，预蛹期高表达的受体有sNPF2受体、Tachykinin2受体、CAPA1和sulfakinin受体，在成虫期仅Tachykinin2受体和BNGR-2保持较高的表达量，其他神经肽受体基因表达量相对较低。

目录

文摘

英文文摘

致谢

基金项目

缩略词表

插图清单

1 前 言

1.1 昆虫神经肽受体研究进展

1.1.1 神经肽作用机制及G蛋白偶联受体

1.1.2 昆虫G蛋白偶联受体(GPCR)分类及分布

1.2 昆虫神经肽促咽侧体素(AT)的研究进展

1.2.1 昆虫神经肽促咽侧体素的分离鉴定

1.2.2 昆虫神经肽促咽侧体素的生理功能

1.3 昆虫促咽侧体素受体研究进展

1.4 本课题的研究意义和研究内容

1.4.1 本课题的研究意义

1.4.2 本课题的研究内容

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要的实验试剂

2.1.2 主要的仪器设备

2.2 家蚕促咽侧体素及其相关神经肽受体全长基因的克隆

2.2.1 RNAiso Plus试剂盒提取RNA

2.2.2 反转录成cDNA第一条链

2.2.3 引物设计及一轮PCR反应

2.2.4 PCR产物的回收

2.2.5 连接反应

2.2.6 感受态细胞的准备

2.2.7 连接产物的转化

2.2.8 阳性克隆的鉴定

2.2.9 家蚕促咽侧体素受体ATR基因的序列测定

2.3 含家蚕促咽侧体素受体基因的重组质粒载体构建

2.3.1 抽提质粒DNA

2.3.2 构建重组质粒

2.3.3 HEK细胞的培养

2.3.4 将重组质粒转染细胞

2.3.5 受体报告质粒检测

2.4 对家蚕促咽侧体素及其相关神经肽受体进行定量表达分析

2.4.1 RNA抽提

2.4.2 使用DNase Ⅰ除去基因组DNA

2.4.3 引物设计

2.4.4 反转录成cDNA第一条链

2.4.5 计算做标准曲线所需体积及稀释倍数

2.4.6 荧光定量PCR

2.4.7 对荧光定量PCR结果数据的处理

3 结果与分析

3.1 家蚕促咽侧体素受体全长基因的克隆及序列分析

3.2 家蚕促咽侧体素受体基因跨膜结构预测及三维结构模拟

3.3 含家蚕促咽侧体素受体重组质粒载体构建及受体鉴定

3.4 家蚕促咽侧体素受体发育表达

3.5 家蚕其他神经肽受体基因发育表达

3.5.1 家蚕神经肽受体A5(BNGR-5)基因发育表达

3.5.2 家蚕抑咽侧体素(allatostatin B)受体基因发育表达

3.5.3 家蚕神经因子F(NPF)受体基因发育表达

3.5.4 家蚕短神经因子F1(sNPF1)受体基因发育表达

3.5.5 家蚕短神经因子F2(sNPF2)受体基因发育表达

3.5.6 家蚕速激肽1受体基因发育表达

3.5.7 家蚕速激肽2受体基因发育表达

3.5.8 家蚕视紫红质受体2基因发育表达

3.5.9 家蚕视紫红质受体3基因发育表达

3.5.10 家蚕蜕皮触发激素1受体(ETH1R)基因发育表达

3.5.11 家蚕BNGR-2基因发育表达

3.5.12 家蚕心动肽CAPA1受体基因发育表达

3.5.13 家蚕肠动肽Proctolin受体基因发育表达

3.5.14 家蚕硫激肽Sulfakinin受体基因发育表达

3.5.15 家蚕Bombesin受体基因发育表达

3.5.16 家蚕神经肽受体发育变化的总结

4 总结与展望

4.1 总结

4.1.1 家蚕促咽侧体素全长基因的克隆及结果分析

4.1.2 含家蚕促咽侧体素受体的重组质粒载体构建及受体鉴定

4.1.3 家蚕促咽侧体素受体基因发育表达

4.1.4 家蚕其他神经肽受体基因发育表达

4.2 展望

4.2.1 家蚕神经肽促咽侧体素受体作用的信号通路

4.2.2 家蚕神经肽促咽侧体素受体的功能

4.2.3 家蚕其它神经肽受体的鉴定及功能

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文