结肠异常隐窝灶形成时期肠道菌群发酵液对结直肠肿瘤细胞生物学行为的影响

摘要

目的：作为全球第三大常见的癌症，结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)的发病率依然呈逐年增高的趋势，其发病的具体机制尚未探明，相关研究认为CRC的发生由多种因素造成，是基因与环境因素共同作用的结果，其中肠道菌群与CRC的发生密切相关。异常隐窝灶(Aberrant Crypt Foci，ACF)已被确定为CRC的一种癌前病变，先于腺瘤的发生，并且目前认为遵循ACF→腺瘤→结直肠癌途径。前期实验已经证实ACF时期肠道菌群及菌群代谢能力发生了改变。因此本实验利用ACF时期中收集的粪便样本，扩增厌氧菌（厌氧菌约占肠道菌群的99％以上），给予一定的底物并提取菌群的发酵液，通过观察肠道菌群发酵液对结直肠肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响以及发酵液对结直肠肿瘤细胞白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、诱导信号传导子及转录激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcrip-tion3，STAT3)及磷脂酰肌醇-3-激酶α亚单位(Phosphatidyl Inositol3-kinase Catalytic Subunit Alpha Isoform,PI3KCA)基因mRNA的表达的影响，探讨菌群的代谢产物对于结直肠肿瘤细胞的影响及其可能的作用机制。　　方法：样本收集：前期实验造模随机分为两组（实验组SD大鼠30只连续2W每W颈背部注射一次致癌剂1，2-二甲基肼(DMH)，对照组SD大鼠12只注射相应体积的空白缓冲液），于造模后开始每隔一周收集一次所有大鼠的粪便样本（3-4粒，约1g），同时随机处死实验组3只，对照组1只大鼠，取全段结肠，行ACF计数。根据前期实验所观察到造模后不同时间点两组大鼠全段结肠肠管的ACF数目及ACF计数方差分析所得的同类子集表结果，选取第2次（第3W）、第4次（第7W）、第8次(第15W)三个时间点收集的两组的粪便进行后续研究。扩增细菌，给予细胞培养基DMEM/F12作为底物进行厌氧发酵，提取菌群的发酵液，根据发酵液的粪便样本来源和收集粪便样本的时间点，分组如下：第2次收集的实验组和对照组的粪便分为S2和D2组，第4次收集的两组粪便分为S4和D4组，第8次收集的两组粪便分为S8和D8组。用各组菌群发酵液干预结直肠肿瘤LoVo细胞株后（设置一个NC组，其他组用一定的浓度梯度发酵液干预时，NC组用DMEM/F12完全培养基作为空白对照组），采用Counting Kit-8（简称CCK-8）法检测各组细胞的增殖抑制状态，采用流式细胞术(Flow Cytometry)、划痕实验(Scratch Test)和Transwell侵袭迁移实验，检测各组细胞凋亡率、迁移和侵袭能力，运用Real-time PCR技术检测各组细胞中IL-6、STAT3及PI3KCA基因mRNA的表达情况。　　结果：1、同种浓度梯度(20％/10％/5％)干预相同时间(24h/48h/72h)。当发酵液浓度为20％，干预细胞24h后，各组的增殖抑制率对比结果如下：S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，S2V.S.S4，S2V.S.S8差异均有统计学意义(P＜0.01)，实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组，而S4VS.S8和D2V.S.D4V.S.D8差异无统计学意义(P＞0.05);当各组发酵液浓度均为10％或5％，干预细胞24h后：统计结果同上。当发酵液浓度为20％，干预细胞48h后，各组的增殖抑制率对比结果如下：S2V.S.D2,S4V.S.D4,S8V.S.D8,S2V.S.S4,S2V.S.S8,S4V.S.S8差异均有统计学意义(P＜0.05)，实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组，且三个实验组S2、S4、S8的抑制率逐渐增高，而D2V.S.D4V.S.D8差异无统计学意义(P＞0.05);当各组发酵液浓度均为10％或5％，干预细胞48h后：统计结果与浓度为20％，干预48h时相同。当发酵液浓度为20％，干预细胞72h后，各组的增殖抑制率对比结果如下：S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，S2V.S.S4，S2VS.S8，S4VS.S8差异均有统计学意义(P＜0.01)，实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组，且三个实验组S2、S4、S8的抑制率逐渐增高，而D2V.S.D4V.S.D8差异无统计学意义(P＞0.05);当发酵液浓度为10％，干预细胞72h后，各组的增殖抑制率对比结果如下：S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，S2VS.S4，S2V.S.S8差异均有统计学意义(P＜0.01)，实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组，而S4V.S.S8和D2V.S.D4V.S.D8差异无统计学意义（P＞0.05）;当各组发酵液浓度均为5％，干预细胞72h后：统计结果与浓度为10％，干预72h相同。同种发酵液三个浓度梯度(20％、10％、5％)干预不同时间(24h、48h、72h)：三个浓度梯度两两比较差异有统计学意义(20％V.S.10％(P＜0.001),20％V.S.5％(P＜0.001),10％V.S.5％(P＜0.001)),且同种发酵液干预相同时间，随干预浓度梯度增加，细胞增殖抑制率有增加的趋势。三个干预时间两两比较差异有统计学意义(24hV.S.48h(P＜0.001),24h V.S.72h(P＜0.001),48h V.S.72h(P＜0.001)），且同种发酵液同种浓度梯度干预，随干预时间的增加，细胞增殖抑制率也增加的趋势。2、采用20％浓度梯度干预72h后，各组细胞凋亡率：NC组的凋亡率低于各组（S2、D2、S4、D4、S8、D8组）（P＜0.05），S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，三个实验组的凋亡率比相对应的对照组凋亡率更高（P＜0.01），三个实验组S2、S4、S4的凋亡率逐渐增高(P＜0.001)，三个D组无统计学意义（P＞0.05）。3、采用20％浓度梯度干预72h后，通过划痕实验观察6h、12h、24h、48h后各组细胞的迁移距离：观察到48h时结果与Transwell迁移实验结果较一致，各组(S2、D2、S4、D4、S8、D8组)均比NC组距离缩短(P＜0.001)，S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8VS.D8，实验组均比相对应的对照组距离更短(P＜0.01)，三个S组比较有统计学意义(P＜0.05)，且S2，S4，S8组的迁移距离越来越短。三个D组的比较无统计学意义(P＞0.05)。4、采用20％浓度梯度干预72h后，通过Transwell迁移实验求得各组细胞迁移抑制率：S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，三个S组的比较均有统计学意义(P＜0.001)，实验组均比对照组迁移抑制率更高，三个S组(S2、S4、S8)的迁移抑制率逐渐升高，三个D组的比较无统计学意义(P＞0.05)。5、采用20％浓度梯度干预72h后，各组细胞侵袭抑制率：S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，三个S组的比较均有统计学意义(P＜0.001)，实验组均比对照组侵袭抑制率更高，三个S组(S2、S4、S8)的侵袭抑制率逐渐升高，三个D组的比较无统计学意义(P＞0.05)。6、采用20％浓度梯度干预72h后，各组细胞IL-6、STAT3、PI3KCA基因mRNA的表达情况：IL-6：NCV.S.S2，NC V.S.S4，NC V.S.S8均有统计学意义（P＜0.05），NC V.S.D2，NC V.S.D4，NC V.S.D8，S2V.S.D2，S4V.S.D4均无统计学意义(P＞0.05)，S8V.S.D8实验组IL-6基因mRNA的表达量更低（P＜0.05），三个S组比较有统计学意义(P＜0.01)，且S2，S4，S8组的IL-6基因mRNA的表达逐渐降低，三个D组比较无统计学意义(P＞0.05);STAT3和PI3KCA：NC组与余组（S2、D2、S4、D4、S8、D8组）的比较无统计学意义(P＞0.05)，S2V.S.D2，S4V.S.D4，S8V.S.D8，三个S组，三个D组的比较均无统计学意义(P＞0.05)。　　结论：1、肠道菌群以细胞培养基DMEM/F12（其主要成分为碳水化合物和氨基酸）作为底物进行厌氧发酵，可能促进有益代谢产物短链脂肪酸（Short-chain Fatty Acids，SCFAs）的产生从而抑制结直肠肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡、降低肿瘤细胞侵袭和迁移的能力。2、给予同种底物(细胞培养基DMEM/F12)的情况下，实验组与相应对照组的菌群发酵液对结直肠肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移这些生物学行为的影响具有差异，可能与各组肠道菌群的种类具有差异以及各组肠道菌群代谢能力变化有关。3、以细胞培养基DMEM/F12作为底物，在ACF时期的肠道菌群与正常肠道菌群进行厌氧发酵的过程中，前者的代谢产物中可能产生更多的SCFAs，从而可能调控IL-6基因水平的表达。

目录

摘要

前言

1．结直肠癌的危害

2．结直肠癌的可能发病因素

3．肠道菌群与CRC的研究现状

4．结直肠癌的癌前病变——异常隐窝灶

5．本文探讨的目的及方法

材料与方法

1．实验材料

2．主要实验试剂

3．主要实验仪器

4．实验方法

1．D2、D4、D8、S2、S4、S8组细胞的增殖抑制情况

2．NC、D2、D4、D8、S2、S4、S8组细胞的凋亡率

3．NC、D2、D4、D8、S2、S4、S8组发酵壬预液对LoVo细胞迂移能力的影响(划痕实验)

4．NC、D2、D4、D8、S2、S4、S8组发酵干预液对LoVo细胞迁移能力的影响(Transwell迁移实验)

5．NC、D2、D4、D8、S2、S4、S8组发酵干预液对LoVo细胞侵袭能力的影响

6．NC、D2、D4、D8、S2、S4、S8组细胞中IL-6、STAT3及P13KCA基因mRNA的表达情况

讨论

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

肠道微生态与大肠癌 综述

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