载5-氟尿嘧啶纳米药物和顺铂的壳聚糖温敏凝胶体系对结直肠癌腹膜扩散的治疗研究

摘要

目的：制备负载5-氟尿嘧啶（5-FU）的纳米药物及构建载5-氟尿嘧啶纳米药物和顺铂的壳聚糖温敏凝胶体系，评价该体系对结直肠癌腹膜扩散的治疗作用。　　方法：本文采用分子量为2000的聚乙二醇（PEG）为大分子引发剂,引发ε-己内酯开环聚合,通过催化剂辛酸亚锡（Sn(Oct)2）催化合成了分子量为3700的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（PCL-PEG-PCL，PCEC）三嵌段共聚物，然后以 PCEC聚合物为载体，通过自组装包载5-氟尿嘧啶形成聚合物胶束（5-FU胶束）。再采用壳聚糖温敏性水凝胶、顺铂和5-FU胶束制备成传输双重药物并具有缓释特性的抗肿瘤药物制剂。通过动态光散射法和透射电镜分别表征5-FU胶束的粒径与形貌，通过高效液相色谱仪测定5-FU胶束的载药率与包封率，以及通过改良透析法研究5-FU胶束、壳聚糖凝胶药物体系的体外药物释放，噻唑蓝（MTT）试验测定5-FU胶束与空白PCEC聚合物的体外细胞毒性，通过流变仪对该壳聚糖凝胶药物体系的流变学特性进行研究。运用BALB/c小鼠建立结直肠癌腹膜扩散（CRPC）模型，随机分为6组（各组分别为12只,6只观察腹腔肿瘤结节重量和数量，6只观察生存期）：(1)生理盐水组(NS组)，(2)空白胶束-凝胶组，(3)5-FU胶束(20 mg/Kg)，(4)载顺铂的壳聚糖凝胶（1mg/kg），（5）氟尿嘧啶注射液（20mg/kg）+顺铂注射液（1mg/kg），（6）壳聚糖凝胶药物体系(又名双重药物缓释制剂组)。接着，腹腔注射200ul上述提及的药物，观察荷瘤小鼠的生存期评估双重药物缓释制剂的体内抗肿瘤疗效。在第21天处死小鼠，因21天后生理盐水组和空白胶束-凝胶组小鼠开始死亡。测定肿瘤结节数量和重量。此外，收集肝肺组织做H&E染色，以此评估肿瘤转移情况。通过免疫组化法测定Ki-67初步探究抗肿瘤可能的机制。　　结果：该研究制备的5-FU胶束具有较高的包封率，呈球形的，平均粒径为22.56 nm，单分散的，有非常窄的粒径分布，且随着载药量增加，平均粒径改变也不大。在体外释放研究结果中表明，5-FU胶束、壳聚糖凝胶药物体系中5-FU和顺铂都能从该凝胶载药体系中释放出来，无明显的突发释放，呈现出缓慢的药物释放行为。MTT结果显示5-FU胶束的细胞毒性明显高于游离5-FU，且空白PCEC聚合物的毒性相对较低，是一种理想的安全的药物传递系统。壳聚糖凝胶药物体系和空白壳聚糖凝胶同样具有良好的温敏特性。体内研究结果表明，与NS组（53.83±9.99,2.31±0.38 g, P＜0.001）、空白胶束-凝胶组（52.67±6.12,2.26±0.28 g, P＜0.001）、5-FU胶束(22.5±4.23,0.99±0.17 g, P＜0.001)、载顺铂的壳聚糖凝胶（23.33±3.56,0.98±0.13 g, P＜0.001）、氟尿嘧啶注射液+顺铂注射液（18.16±3.06,0.79±0.13 g, P＜0.05）相比，壳聚糖凝胶药物体系的肿瘤结节的数量和重量(10.33±2.66,0.49±0.11 g)显著减少，明显抑制了肿瘤的生长，且空白胶束-凝胶组则没显示出任何的抗肿瘤作用。壳聚糖凝胶药物体系组的中位生存期为43天，与NS组（25天）、空白胶束-凝胶组（26天）、5-FU胶束（31天）、载顺铂的壳聚糖凝胶组（33天）、氟尿嘧啶注射液+顺铂注射液组（35天）相比是明显延长的。此外，观察结直肠癌腹膜扩散小鼠的肝肺转移情况，通过肝肺组织的 H&E染色结果表明，壳聚糖凝胶药物体系可以在一定程度上抑制结直肠癌腹膜扩散后继续向肝肺组织的转移。壳聚糖凝胶药物体系Ki-67阳性表达细胞数（21.83±5.71％）的比例明显低于NS组（83.67±4.89%, P＜0.001）、空白胶束-凝胶组（80.67±3.78%, P＜0.001）、5-FU胶束（57.00±5.66%, P＜0.001）、载顺铂的壳聚糖凝胶组（55.50±4.64%, P＜0.001）、氟尿嘧啶注射液+顺铂注射液组（39.50±3.94%, P＜0.001），且都具有统计学意义。　　结论：PCEC聚合物联合单纯的壳聚糖水凝胶组成的双重载药体系的毒性是相对较低，是一种理想的安全的药物载体。载5-氟尿嘧啶纳米药物和顺铂的壳聚糖温敏凝胶体系具有良好的温敏性特性，通过腹腔注射到结直肠癌腹膜扩散动物模型后，在肿瘤组织位置形成一个原位的药物释放中心，起到持续抗肿瘤的作用，一定程度的抑制肿瘤肝肺的转移，同时减少了传统给药途径引起的全身毒副作用。因此，该药物制剂具有良好的临床应用前景，可用于肿瘤局部治疗的新制剂。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物：

1.2 细胞系：

1.3 主要实验试剂：

1.4 主要实验仪器

2.1 PCEC聚合物制备

2.2 5-FU胶束的合成

2.3 5-FU胶束的粒径测量和形貌

2.4 5-FU胶束的载药量与包封率检测

2.5 5-FU胶束及壳聚糖凝胶药物体系的体外释放实验

2.6 5-FU胶束的体外细胞毒性评价

2.7 壳聚糖水凝胶的制备

2.8 壳聚糖凝胶药物体系的制备及流变特性

2.9 结直肠癌腹膜扩散（CRPC）小鼠模型的建立和治疗

2.10 免疫组化分析

2.11 抑制肿瘤的肝肺转移

2.12 统计学分析

结果

1.1 5-FU胶束的制备及表征

1.2 载药量与包封率检测

1.3 5-FU胶束及壳聚糖凝胶药物体系的体外释放曲线

1.4 5-FU胶束的体外细胞毒性分析

1.5 壳聚糖凝胶药物体系的制备和流变特性

1.6 壳聚糖凝胶药物体系对CRPC小鼠模型的抗肿瘤作用

1.7 肿瘤细胞增殖的评估

1.8 抑制肿瘤的肝肺转移

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:温敏性壳聚糖水凝胶研究进展

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