Pin1介导高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡中SIRT1核-浆穿梭改变

摘要

目的:Pin1是人类肽基脯氨酰异构酶，实验组前期发现，Pin1参与细胞氧化应激通路，抑制其表达后可能够减少高氧所造成的肺损伤，而SIRT1称为沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1，主要定位于细胞核中，其发挥活性参与调节细胞氧化应激过程。本实验建立在稳定抑制肽基脯氨酰顺反异构酶(Pin1)表达的A549细胞系基础上，当暴露于高氧环境下，SIRT1能否发生核-浆穿梭反应，导致SIRT1活性降低，抗氧化应激能力下降，增加高氧肺损伤可能，而在抑制了Pin1表达的A549细胞中能否减轻SIRT1核-浆穿梭反应，从而减轻高氧肺损伤。　　方法:通过本实验组前期实验获得稳定抑制Pin1表达的A549-Pin1shRNA细胞系。随后将实验分为三组:对照组、高氧组，A549-Pin1shRNA组。对照组是通过含有10％胎牛血清和1％青链霉素的1640培养基中常规培养。高氧组及A549-Pin1shRNA组均通过通入3L/min的95％氧气和5％二氧化碳高纯混合气10min，并在培养箱中密培养24h的高体积分数氧（高氧）诱导细胞。培养结束后收集细胞进行以下检测:倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态学改变;采用SP细胞免疫化学方法检测各组细胞中Caspase3、p53蛋白的表达;荧光显微镜检测定位SIRT1核-浆穿梭情况。　　结果:(1)在倒置显微镜下，对照组细胞生长状态良好，细胞活性好，活细胞数量多，少见细胞漂浮于培养基中，细胞呈梭形，细胞间隙较小，连接紧密。高氧组细胞生长状态差，活细胞明显较对照组明显减少，培养基中可见大量细胞漂浮，剩下的活细胞排列松散，细胞间隙较前明显增宽。而A549-Pin1shRNA组生长状态欠佳，活细胞数量较高氧组多，悬浮在培养基中的细胞较高氧组少，但未达到对照组水平;(2) SP细胞免疫化学方法检测各组细胞中Caspase3、p53蛋白的表达:高氧组与对照组相比，Caspase3、p53蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05);而A549-Pin1shRNA组中Caspase3、p53蛋白表达较前有所降低，其值介于高氧组与对照组之间，与高氧组、对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);(3)荧光显微镜检测定位SIRT1核-浆穿梭情况:细胞核染成蓝色荧光，SIRT1染色成红色荧光，其在细胞质及细胞核内均有表达，而主要是在细胞核中发挥其作用。对照组细胞质中红色荧光表达微弱，而高氧组中细胞质红色荧光表达最强，在A549-Pin1shRNA组红色荧光含量较对照组有所增多，差异有显著性(P＜0.05)，但未达到高氧组水平(P＜0.05)。　　结论:高氧能够诱导细胞内Pin1介导p66shc在线粒体的转位增多，使得线粒体内活性氧产生增多，而在抑制Pin1表达的A549-Pin1shRNA细胞系中，能够减少SIRT1的核-浆穿梭，减少SIRT1活性的下降，从而减少Caspase3、p53的生成，减轻高氧肺损伤，这有望成为高氧肺损伤新的治疗途径。

目录

论文说明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法与分组

5 统计学处理

结果

1 倒置相差显微镜观察高氧诱导各组细胞形态学改变

2 SP细胞免疫化学方法检测各组细胞中Caspase 3、p53蛋白的表达

3 免疫荧光法定位SIRT1核-浆穿梭改变

讨论

1 SIRT1目前主要研究方向

2 Pin1参与的氧化应激通路

3 Caspase 3、p53在细胞凋亡中的作用

4 Pin1介导高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡中SIRT1核-浆穿梭

结论

参考文献

英文缩写及中英文对照

致谢

综述 SIRT1在炎症反应和细胞衰老的研究进展

攻读硕士学位期间发表和撰写的论文

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