Oct4、Sox2、C-Mye、Klf4-腺病毒载体的构建与包装及感染小鼠的胚胎成纤维细胞的实验研究

摘要

背景:诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)是选用某些特异的转录因子，将体细胞重编程为具有多能性的干细胞。由多种体细胞建立的iPSCs，如今已成为生命科学领域不可或缺的研究素材，其拥广阔的应用前景。本实验为提高iPSCs建系效率、降低诱导成本、把握质量控制关键点为参考条件，以促进其在临床应用中的发展。在分化的成体细胞表达的目的转录因子-Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc，并将其体细胞重编程为诱导多功能干细胞，这一革命性的研究策略很快吸引了公众和科学界的注意，是因为此技术很好的避免了干细胞应用中的伦理道德约束和免疫排斥问题。病人特异的iPSCs的应用为遗传性疾病和退行性疾病的临床治疗带来了新的希望。　　目的:(1)本实验构建携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四个目的基因的质粒，并通过质粒的提取和纯化成功包装能同时表达这4种转录因子的腺病毒(Adenovirus vector)，并通过目的基因过表达腺病毒颗粒感染小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts MEF），目的在于探讨诱导多功能干细胞成功诱导提供方法。　　方法:(1)从携带Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4的四个质粒中获取目的基因，然后将酶切线性化后的腺病毒载体与目的基因进行精准连接，利用酶切及PCR方法测定病毒载体的正确性，对培养出的阳性克隆予以序列检测，序列正确且一致表明成功构建质粒，并对质粒进行提取和纯化，观察病毒感染HEK293细胞二十四小时后的表达情况，测定病毒的功能及滴度。(2)用胰蛋白酶消化法在体外培养分离MEF，对MEF细胞的生长状态进行观察，用不同胎龄的小鼠，不同浓度胰蛋白酶作用时间对MEF培养的影响进行观察对比研究;(3)利用腺病毒空病毒颗粒感染MEF，并以不同MOI值腺病毒分别感染MEF，并得出感染最佳值。(4)将生长状态良好的MEF细胞随机分成a、b、c三组，用携带目的基因的腺病毒感染a组、空病毒颗粒腺病毒感染b组、无病毒感染的c组，在倒置显微镜下观察期形态变化，最终得出最佳的实验条件。　　结果:(1)载体酶切线性化后成功与目的基因PCR酶切产物对接，其阳性克隆产物鉴定后证实腺病毒载建立成功，且测序结果与目标序列一致，腺病毒滴度为1×1010PFU/ml;(2)采用胰蛋白酶分次消化法培养MEF，13.5d胎龄鼠胚的MEF分离培养为最佳，MEF培养24小时后大部分贴壁生长，细胞传代至第三代较为旺盛。(3)摸索出腺病毒感染MEF的最佳区间为20-100，将携带目的基因感染组与正常对照组及空病毒感染组对比分析，a组细胞出现了由长梭形变成类似球形和不规则形生长，相同条件下b、c两组未出现明显变化。　　结论:本实验成功建立了高质量的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4-腺病毒载体，并成功进行了MEF的原代及传代培养，并感染了小鼠胚胎成纤维细胞，观察诱导MEF的形态变化，探讨了iPSCs技术的关键问题。

目录

摘要

前言

材料与方法

Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4腺病毒载体的包装

小鼠胚胎成纤维细胞的制备

Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4腺病毒载体感染小鼠的胚胎成纤维细胞

结果

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述 诱导多功能干细胞I临床应用的研究进展

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