兔膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞的体外培养及支架复合物的构建

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一章：兔膀胱平滑肌细胞的原代培养及鉴定。　　目的：通过研究兔膀胱平滑肌的体外培养及鉴定方法，为构建组织工程新膀胱提供实验依据。　　方法：采用獭兔在无菌条件下切除部分膀胱组织，将取下的膀胱分成两部分，在解剖显微镜下将上皮和平滑肌分离，分别采用组织块法和酶消化法分别获取原代细胞，并以含10％FBS的DMEM进行培养，观察记录两种方法由原代培养至传代所需的时间和细胞在生长过程中的形态及增殖情况，通过免疫组化方法鉴定细胞。　　结果：组织块法原代培养成功11次，失败1次，酶消化法原代培养成功6次，失败6次，两种方法的成功率有显著性差异（P<0.05）。组织块法原代培养至传代所需的时间为10.18±0.98天，而酶消化法为4.17±0.75天，两种方法的原代培养时间有显著性差异（P<0.05）。倒置显微镜下观察细胞形态呈长梭形，并出现典型的“峰谷”样结构，传代细胞的平滑肌肌动蛋白抗体染色呈阳性反应。　　结论：应用组织块培养法能够更好的提高细胞体外获取的成功率，所培养出来的膀胱平滑肌细胞纯度高，完全可作为构建组织工程膀胱的种子细胞。　　第二章：兔膀胱上皮细胞的原代培养及鉴定。　　目的：通过探索兔膀胱移行上皮细胞的体外分离、原代培养、扩增及鉴定的方法,为其作为种子细胞构建新膀胱提供实验依据。　　方法：采用獭兔在无菌条件下切除部分膀胱组织，将取下的膀胱分成两部分，在解剖显微镜下将上皮和平滑肌分离，分别采用组织块法和酶消化法分别获取原代细胞，并以含EGF、BPE的DMEM/F12培养基进行培养，观察记录两种方法由原代培养至传代所需的时间和细胞在生长过程中的形态及增殖情况，通过免疫组化方法鉴定细胞。　　结果：组织块法原代培养成功10次，失败2次，酶消化法原代培养成功11次，失败1次，两种方法的成功率无显著性差异（P>0.05）。组织块法原代培养至传代所需的时间为10.00±1.00天，而酶消化法为4.00±0.67天，两种方法的原代培养时间有显著性差异（P<0.05）。倒置显微镜下观察细胞形态呈典型的“铺路石”样结构，传代细胞免疫组化染色呈阳性反应。　　结论：采用酶消化法可以从较少的组织中在短时间内获得大量纯度高、活力好的膀胱移性上皮细胞，通过4一5天培养原代细胞能融合至80%一90%,表现出典型的”铺路石”样结构,传代后细胞能够稳定生长，能为构建组织工程新膀胱提供可靠的依据。　　第三章：兔膀胱平滑肌细胞及移行上皮细胞与支架复合物的构建。　　目的：观察膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞混合培养在脱细胞的膀胱支架上的生长状况,为组织工程膀胱种子细胞和支架材料的进一步研究提供实验依据。　　方法：将兔膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞分别接种到脱细胞的膀胱支架材料上复合培养,于1周及10天后取出细胞一支架复合物,4%甲醛固定行石蜡切片H-E染色电镜观察两种细胞的生长情况。　　结果：石蜡切片H-E染色观察脱细胞的支架，观察到其有很好的纤维网结构，未见细胞残留。将膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞种植到脱细胞的支架上未见其生长。　　结论：膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞未能和脱细胞的膀胱支架进行融合。

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第一章 兔膀胱平滑肌细胞的原代培养和鉴定

引言

1. 材料和主要试剂

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

5. 结论

6. 参考文献

第二章 兔膀胱上皮细胞的原代培养及鉴定

引言

1.材料和主要试剂

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

5. 结论

6. 参考文献

第三章 兔膀胱平滑肌细胞及移行上皮细胞与膀胱支架复合物的构建

引言

1.材料和主要试剂

2.实验方法

3.结果

4.讨论

5. 结论

6.参考文献

文献综述:组织工程支架材料在膀胱修复中的应用新进展

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