脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的筛选、降解酶的纯化及其降解效果的初步研究

摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(DON)又称为呕吐毒素,广泛存在于大自然中,能够对谷物和饲料带来严重污染,是一种全球性的污染毒素。目前,生物降解法被认定为是降解DON的最佳方法。基于以上所述,本文筛选出一株产DON降解酶的菌株,对其进行了形态和分子生物学鉴定,纯化了DON降解酶并对其进行分析鉴定和相关性质研究,用纯化的降解酶作用于DON对其降解效果和降解产物进行分析研究。研究结果如下:
　　(1)从土壤中分离的53个单菌落和15个供试菌种中初筛得到3株菌种B-1、F-1和F-2,经过复筛发现菌株F-1胞内液的酶活力高达56.5,表明该降解酶为一种胞内酶。
　　(2)对菌株F-1进行形态鉴定和ITS鉴定,将扩增的目的基因与Genbank数据库(NCBI)进行Blast序列对比,鉴定结果显示菌株F-1与多株黑曲霉同源性均达到99％,表明菌株F-1是一株黑曲霉。
　　(3)对菌株F-1中的降解酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳结果为单一条带,说明得到较纯的降解酶,其纯化倍数为42.6,回收率达到26.2%。
　　(4)液相质谱(1D-LC-MS)分析鉴定结果显示该降解酶的含354个氨基酸,分子量为40.5kDa,等电点为6.01,测得的氨基酸序列与NIBC的数据库中的蛋白YALI0A01441p高度匹配,表明该降解酶为一种脂肪酶。
　　(5)降解酶的性质研究发现,酶的最适反应温度和最适 pH分别为40℃和8.5,Ca2+、Mg2+(1.0mM)和Fe2+能够进一步激活酶的活性,Zn2+和Cu2+则是很强的酶活抑制剂。有机溶剂对酶活力的影响降序排列顺序为:甲醇>乙醇>DMSO>EDTA>丙酮。
　　(6)高效液相色谱(HPLC)检测结果表明,DON被脂肪酶降解,其降解率达70%以上。薄层色谱(TLC)检测结果显示,在365nm紫外灯的照射下,可见DON的降解产物的白色亮斑,其Rf值为0.28。
　　(7)液相质谱(LC-MS)对DON的降解产物分析结果显示, DON经过脂肪酶的降解,分子量从原来的296.00变为314.00,分子量增加了18.00。推测可能是DON结构中的环氧键被脂肪酶催化降解生成两个羟基。

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第一章 绪论

1.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的简介

1.2 DON的研究进展

1.3 DON的毒性

1.4 DON的分离检测方法

1.5 DON的降解方法

1.6 研究的目的和意义

1.7研究内容和技术方案

第二章 DON降解菌的筛选及鉴定

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4结果与分析

2.5 本章小结

第三章 降解酶的提取分离、纯化鉴定及性质研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 本章小结

第四章 降解酶对DON降解效果的研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况