基于人脐静脉内皮细胞外泌体探讨启膈散对食管癌EC9706细胞顺铂敏感性影响

摘要

目的：　　研究人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与食管癌细胞（EC9706）间基于外泌体的信息交流，以及启膈散对HUVEC外泌体中miR-21的影响，以探讨HUVEC与EC9706共培养条件下EC9706对顺铂的耐药性机制，以及方药启膈散基于外泌体对食管癌EC9706顺铂耐药影响的部分机制。　　方法：　　1.HUVEC细胞外泌体的提取与鉴定：利用细胞培养技术常规培养HUVEC细胞，收集HUVEC细胞的上清液，以ExoQuick-TC Exosome Isolation Reagent外泌体提取试剂盒提取HUVEC上清中的外泌体，以透射电子显微镜技术观察HUVEC外泌体的大小和形态是否符合外泌体的定义，以Western Blot技术鉴定外泌体的表面标记性蛋白Alix和CD-9的表达情况。　　2.EC9706细胞对HUVEC外泌体的摄取：提取HUVEC外泌体，利用PKH26染色试剂盒染色外泌体，把染色后的外泌体与EC9706细胞共同培养24h，利用激光共聚焦显微镜观察EC9706细胞对HUVEC分泌的外泌体是否有摄入。　　3.MTT法检测HUVEC外泌体与EC9706细胞共培养条件下顺铂对EC9706的细胞毒作用：实验分为：单独培养EC9706组、HUVEC外泌体与EC9706共培养组。设置5个顺铂浓度：0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，每个浓度设置3个复孔。以MTT法检测两组细胞的OD值，计算两组细胞对顺铂的IC50值，对比两组顺铂对EC970细胞毒性差异。实验重复3次。　　4.qRT-PCR技术检测HUVEC细胞外泌体中miR-21表达量：以5%启膈散含药血清与5%对照血清分别培养HUVEC细胞，提取两组细胞外泌体中的RNA，反转录RNA，利用qRT-PCR技术检测两组HUVEC细胞外泌体中miR-21表达量的差异。实验重复3次。　　结果：　　1.利用外泌体提取试剂盒提取到外泌体白色沉淀，利用透射电子显微镜观察到HUVEC外泌体呈囊泡样结构，其直径大小在30-100nm之间，Western Blot检测到HUVEC外泌体的Alix和CD-9蛋白表达为阳性。　　2.激光共聚焦显微镜观察到EC9706细胞可摄取HUVEC外泌体。　　3.HUVEC外泌体与EC9706共培养条件下，EC9706对顺铂的IC50=3.84±0.45μg/mL；单独培养EC9706条件时，EC9706对顺铂的IC50=2.69±0.23μg/mL，两者比较有统计学意义（P<0.05）。　　4.5%对照血清组HUVEC外泌体的miR-21表达量为1.00±0.00，5%启膈散血清组HUVEC外泌体的miR-21表达量为7.58±2.51。5%启膈散含药血清组HUVEC外泌体的miR-21比5%对照血清组HUVEC外泌体的miR-21表达量明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。　　结论：　　1.EC9706细胞对HUVEC外泌体有摄取作用。　　2.HUVEC外泌体增加了EC9706对顺铂的耐药。　　3.5%浓度的启膈散含药血清没有降低共培养条件下EC9706对顺铂的耐药性并且上调了共培养条件下EC9706的miR-21的含量，可能与该浓度下HUVEC外泌体中miR-21高表达，并被EC9706细胞摄取有关。

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摘要

Abstract

缩略语表

前言

第一部分HUVEC外泌体的提取与鉴定

实验材料

1 实验细胞

2 实验试剂与仪器

实验方法

1 细胞培养

2 HUVEC细胞外泌体的提取与鉴定

实验结果

1 HUVEC外泌体的形态大小

2 HUVEC外泌体蛋白与HUVEC细胞标记蛋白表达

第二部分 EC9706细胞对HUVEC外泌体的摄取

实验材料

实验试剂与仪器

实验方法

实验结果

第三部分 HUVEC外泌体与EC9706共培养条件下顺铂对EC9706的细胞毒作用

实验材料

1.实验试剂与仪器

2.试剂配制

实验方法

1 HUVEC外泌体与EC9706共培养条件下顺铂对EC9706的细胞毒作用

2 统计学方法

实验结果

HUVEC外泌体与EC9706共培养条件下顺铂对EC9706的细胞毒作用

第四部分 启膈散含药血清对HUVEC外泌体中miR-21的影响

实验材料

1 实验试剂与仪器

2 引物序列

3 试剂配置

实验方法

1 细胞处理

2 反转录

3 实时荧光相对定量实验（RT-qPCR）

4 统计学方法

实验结果

启膈散含药血清组与对照血清组HUVEC外泌体中miR-21差异

讨论

1 外泌体的提取与鉴定

2 HUVEC外泌体与EC9706共培养条件下EC9706对顺铂耐药的影响

3 启膈散含药血清对HUVEC外泌体中miR-21的影响

4 展望

结论

致谢

参考文献

附录

附录1 实验图片

附录2 综述

附录3 本人在校期间发表的论著