不同基因型新城疫病毒对鹌鹑的致病性及TLRs信号通路相关因子表达差异研究

摘要

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)强毒株引起的一种急性、烈性传染性疾病。近年来，该病已成为危害鹌鹑养殖业的主要疫病之一。我国多个省份已有该病暴发和流行的报道，在经济上给鹌鹑养殖业造成重大的损失。　　本研究根据GenBank上发表的不同禽类Toll样受体信号通路中部分固有免疫相关因子（TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9）及内参基因(β-actin)的序列并参阅相关文献报道，设计并合成7对特异性引物。利用合成的引物通过PCR方法扩增出目的片段，然后进行基因克隆，构建质粒标准品，建立检测上述基因的荧光定量PCR方法(qRT-PCR)，进行特异性和重复性试验。结果表明，建立的TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9和β-actin实时荧光定量PCR标准曲线的线性相关系数在0.99～1.00之间、扩增效率在1.83～2.13之间且溶解曲线在40个循环内呈现单一溶解峰。重复性检验结果中各目的基因批内和批间变异系数都小于4.0％，标准差小于0.5。上述结果证明建立的qRT-PCR检测方法具有特异性强、稳定性和可重复性高的特点，为定量分析鹌鹑固有免疫相关因子mRNA转录水平提供了技术支持。　　为探究不同基因型NDV对鹌鹑的致病性差异，本课题选用基因Ⅶ型GXQ53毒株、基因Ⅷ型GXGF12001毒株和基因Ⅸ型F48E8国内参考毒株人工感染35日龄的非免疫鹌鹑，观察、记录试验动物临床症状并打分，在感染后5、8、11天观察各试验组鹌鹑的脾脏、大脑和盲肠扁桃体的病理学变化并记录得分;采集组织样品进行病理组织学观察、病毒载量测定和0固有免疫相关因子基因表达量的测定。具体结果如下:　　(1)感染组均表现出典型的新城疫临床症状和剖检病变，其中F48E8组、GXGF12001组、GXQ53组临床症状得分分别为12.0分、6.0分和6.0分，剖检病变平均得分分别为3.0分、1.67分和1.83分。病理组织学检测结果表明，F48E8、GXGF12001和GXQ53毒株对脾脏、盲肠扁桃体和脑均能产生不同程度的损伤，其中脾脏和盲肠扁桃体两个免疫器官均表现出淋巴细胞减少、出现坏死灶，随着感染时间增加F48E8组和GXGF12001组病变加剧，而GXQ53组有逐渐转归的迹象。而大脑的病变以小胶质细胞增生为主，随着时间推移病变都有加剧的趋势。综合病理组织结果来看，F48E8对免疫系统和神经系统的损伤能力比GXGF12001的强，而GXQ53组弱于前两组。　　(2)试验组鹌鹑的脾脏、盲肠扁桃体和大脑中病毒载量检测结果表明，F48E8毒株和GXGF12001毒株不仅可在脾脏和盲肠扁桃体中复制，还可以通过血脑屏障浸染到大脑中。而GXQ53毒株只在盲肠扁桃体中复制。病毒拷贝数显示脾脏中GXGF12001毒株的复制能力强于F48E8毒株，而F48E8毒株在脑中的复制能力强于GXGF12001毒株。盲肠扁桃体中复制能力强弱顺序为:GXGF12001毒株＞F48E8毒株＞GXQ53毒株。　　(3)鹌鹑感染NDV后不同组织中固有免疫相关因子的相对表达量结果如下:TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9在脾脏、大脑和盲肠扁桃体中都有表达。其中，TLR3、IL-6和IL-8在脾脏中表达显著上调(P＜0.05)，盲肠扁桃体中TLR7、IL-8、AvBD-9和IL-6表达显著上调(P＜0.05)，脑中IFNα和AvBD-9显著上调(P＜0.05)，且这些组织中细胞因子的相对表达量与病毒的拷贝数趋于正相关。综上所述，我们推测TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9可能参与鹌鹑对NDV感染的免疫反应。　　本课题成功建立了检测鹌鹑固有免疫相关因子TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9和内参基因β-actin荧光定量方法;人工感染试验表明基因Ⅶ型GXQ53毒株、基因Ⅷ型GXGF12001毒株和基因Ⅸ型F48E8毒株对非免疫鹌鹑具有组织嗜性，病毒可在脾脏、盲肠扁桃体和大脑中增殖并对这些组织器官造成损伤，且F48E8毒株的致病性强于GXGF12001毒株，而GXQ53毒株的致病性最弱，它们都能引起鹌鹑的发病死亡。由所检测的细胞因子mRNA结果推测TLR3、TLR7、IL-8、IFNα在鹌鹑脾脏、脑和盲肠扁桃体中可能参与鹌鹑对新城疫病毒感染的免疫反应，而IL-6在脾脏和盲肠扁桃体中表达量显著上调，以及AvBD-9在脑中的表达量显著上调，可能与TLR7介导的MyD88依赖途径以及TLR3介导的TRIF依赖途径有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 文献综述

1．1 新城疫的流行历史及现状

1．2 新城疫及新城疫病毒

1．2．1 NDV的分类地位及结构

1．2．2 NDV的理化性质

1．2．3 NDV的培养特点

1．2．4 NDV基因组结构

1．3 新城疫病毒的致病性

1．3．1 决定NDV毒力与致病性的因素

1．3．2 不同基因型NDV对鹌鹑的致病性研究进展

1．4 家禽对新城疫病毒的免疫应答

1．4．1 家禽对NDV的天然免疫应答

1．4．2 家禽对NDV的体液免疫应答

1．4．3 家禽对NDV的细胞免疫应答

1．5 新城疫检测方法

1．6 新城疫的防制

1．6．1 综合性防制

1．7 研究目的和意义

第2章 免疫相关细胞因子实时荧光定量PCR标准曲线的建立

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．2．1 引物的设计和合成

2．2．2 总RNA的提取及cDNA的合成

2．2．3 细胞因子PCR扩增

2．2．4 细胞因子重组质粒的构建

2．2．5 质粒的提取

2．2．6 质粒标准品的制备

2．2．7 细胞因子实时荧光定量PCR标准曲线的建立

2．2．8 重复性试验

2．3 试验结果

2．3．1 细胞因子PCR结果

2．3．2 质粒浓度及拷贝数

2．3．3 细胞因子实时荧光定量PCR标准曲线的建立

2．3．4 溶解曲线分析结果

2．3．5 重复性及敏感性试验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 不同基因型新城疫病毒对鹌鹑致病性的研究

3．1 材料

3．1．1 病毒毒株和鸡胚

3．1．2 试验动物和细胞

3．1．3 主要试剂和仪器

3．2 方法

3．2．1 蚀斑纯化

3．2．2 鹌鹑的分组与准备

3．2．6 病毒载量测定

3．2．7 细胞因子表达量检测

3．2．8 数据统计分析

3．2．9 病理切片的制备

3．3 结果

3．3．1 蚀斑纯化结果

3．3．2 鹌鹑的临床症状分数和解剖病变分数

3．3．3 抗体变化趋势图

3．3．4 三组攻毒组病毒载量的差异

3．3．5 三组攻毒组细胞因子表达差异

3．3．6 病理组织学结果

3．4 讨论

3．5 小结

第4章 结论

参考文献

致谢

个人简历

研究生期间发表论文情况及参与的科研项目发表论文