1,25(OH)2D3诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化并构建长段组织工程神经的研究

摘要

第一部分：1,25(OH)2D3诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化的研究　　目的：培养、纯化SD大鼠的神经干细胞(NSCs)，并诱导NSCs在短时间内大量地分化为少突胶质细胞；探讨得到高纯度高浓度少突胶质细胞的实验方法；观察并分析由NSCs分化而来的少突胶质细胞生长、转归等生物学特性。　　方法：新生 SD大鼠（48 h内），麻醉消毒后取双侧大脑皮层，剔除脑膜、血管等组织。将大脑皮层剪成糜状，反复吹打后过滤，加入 DMEM/F12培养基，然后将细胞密度调整为5×105 cells/mL，按比例添加神经生长因子 EGF（20 ug/mL）, bFGF（10 ug/mL），B27（20 ul/mL）进行培养。取第三代NSCs进行免疫细胞化学鉴定。以含10％FBS的DMEM为特定培养基重悬离心后的神经球，开始培养。次日添加浓度为1×10-6 mol/L的1,25(OH)2D3诱导分化培养7 d。用0.0125%胰酶溶液短时消化，FBS终止消化并轻轻震动。收集细胞悬液离心，弃上清液，用含10% FBS的DMFM重悬细胞继续培养，台盼兰染色计算分化细胞的总数；次日再次加入浓度为1×10-6 mol/L的1,25(OH)2D3继续分化培养7 d，消化细胞后离心，弃上清，用含10% FBS的DMFM重悬细胞，台盼兰染色计算分化细胞的总数。第一次和第二次加入诱导剂分化培养7d后，分别取出其中12孔的盖玻片分两组进行 GC和 GFAP免疫组化鉴定；另12孔用0.0125%胰蛋白酶消化1 min后，取出盖玻片分两组分别进行GC和GFAP免疫组化鉴定。即可按A、B、C、D四组进行鉴定：A组为第一次诱导直接鉴定组；B组为第一次诱导消化后鉴定组；C组为第二次诱导直接鉴定组；D组为第二次诱导消化后鉴定组。将获得的少突胶质细胞按照常规方法进行冻存复苏，观察复苏后少突胶质细胞的生长等生物学特性。　　结果：NSCs在培养液中悬浮生长，培养3 d左右，数十个NSCs增殖成团状，仍呈悬浮生长；神经团逐渐增大，培养7 d左右可出现较大典型的神经球。免疫细胞化学结果显示，神经球的表面含大量Nestin阳性细胞，其着色范围与细胞的形态大致相同。鉴定分化培养24 h，神经球的四周形成较多突起，临近神经球之间的突起相互连接形成网格状结构。培养7 d后出现有较多的NF-200阳性的细胞和部分GFAP阳性的细胞，其着色区域与各细胞形状大致相同。第一次加入1,25(OH)2D3诱导剂，神经球向四周分化形成较多突起，临近神经球之间的突起相互连接形成网格状结构。同时也可见单个细胞贴壁分化，一般长出1～2个突起。分化培养3d后瓶底出现较多的胶质细胞，贴壁生长，部分细胞有1～2个突起，或者3～4个突起；培养7d左右神经球完全分化，不见神经球的形态，部分较大的球中心细胞未分化者则裂解成片状漂浮在瓶中。瓶底铺满细胞，以有1～2个突起的细胞为主，可见部分细胞有3～4个突起。第二次加入1,25(OH)2D3诱导剂，继续培养7 d，瓶底铺满细胞，以1～2个突起的细胞为主，4～5个突起的细胞较少。台盼兰染色计算分化细胞的总数，第一次诱导分化所得细胞总数为（1.51±0.08）×106个，第二次诱导分化所得细胞总数为（1.34±0.12）×106个，两者存在显著性差异（P＜0.05）。免疫细胞化学结果：A组 GC阳性细胞率为(64.90±3.38)%，GFAP阳性细胞率为（32.30±2.90）%；B组GC阳性细胞率为（4.70±1.33）%，GFAP阳性细胞率为（31.10±2.42）%；C组GC阳性细胞率为（90.10±2.72）%，GFAP阳性细胞率为（10.00±1.88）%；D组GC阳性细胞率为（6.90±1.91）%，GFAP阳性细胞率为（9.90±1.66）%；A组与C组之间差异存在统计学意义（P＜0.05）；而A组与B组，C组与D组的GFAP阳性细胞率无统计学差异（P＞0.05）。冻存不同时段的OL复苏，其成活比例可达50～60％，继续培养细胞生长良好，细胞形态与生长状况接近于冻存前。　　结论：1,25(OH)2D3作为诱导剂，结合特定培养基可以诱导NSCs大量地向少突胶质细胞分化，首次采用二次诱导及低浓度胰酶短时消化法进一步纯化细胞，从而在短时间内获得高纯度高浓度的少突胶质细胞。　　第二部分：脱细胞神经支架复合神经干细胞来源的少突胶质细胞构建长段组织工程神经的研究　　目的：通过改良化学法制备保留空间三维结构、低免疫源性的人体胫神经脱细胞神经支架（ANGs）；联合源于SD大鼠NSCs的少突胶质细胞和由人体胫神经制备的ANGs构建长段组织工程神经，研究组织工程神经的生物学特性，探讨构建理想组织工程神经的适宜条件。　　方法：采用改良化学法制备人体胫神经ANGs，取32段人体胫神经，每段长约30 mm。①去除取自废弃截肢肢体的胫神经干外层松散的纤维结缔组织；②将0.05 mol/L Tris-Hcl溶液以及蛋白酶抑制剂添加到50毫升离心管中，恒温（4℃）震荡24 h。③将离心管内的液体换成含3%TritonX-100的磷酸盐缓冲液，恒温（4℃）震荡24 h，蒸馏水浸泡12 h，再连续清洗3次。④离心管内原液体用4%脱氧胆酸钠溶液替换，并室温振荡24 h，再用无菌双蒸水冲洗3次。⑤重复第3~4的步骤1次，将制备好的ANGs保存于PBS液（4℃）备用。取制备的ANGs和人体胫神经行H-E染色、透射电镜和免疫组化检测，评估ANGs的制备效果。将组织工程神经随机分为A、B、C、D、E五组，每组5段，每段长约30 mm，每组复合细胞的密度不同。①A组：注射密度5×105 cells/mL，培养基中密度5×105 cells/mL；②B组：注射密度为1×106 cells/mL；培养基中密度5×105 cells/mL；③C组：注射密度1×107 cells/mL；培养基中密度5×105 cells/mL；④D组：未注射细胞；培养基中密度5×105 cells/mL；⑤E组：注射密度1×106 cells/mL，培养基中不含细胞。分别于细胞移植共培养7 d和14 d后检查各组细胞在支架的粘附情况。培养7 d时从每段组织工程神经的中点横行切断，取长为15 mm的组织工程神经，行纵切面免疫组化检测。用IPP6.0软件进行GC阳性细胞计数。每段剩余的15 mm组织工程神经继续培养。培养14 d时检测方法同前。并进行统计分析。取SD大鼠15只随机分为3组，剪去大鼠背部毛发，备皮消毒，麻醉后进行皮下包埋，分别包埋B组组织工程神经（培养14 d）、SD大鼠坐骨神经和人体胫神经。继续喂养7 d，取包埋神经进行HE染色检测淋巴细胞浸润情况，并进行统计分析。　　结果：ANGs的H-E染色纵切片上可见较多整齐分布的管道样结构，基本无细胞成份；横切片上未见细胞成份成份和髓鞘，基底膜保留较完整。透射电子显微镜下未见髓鞘和细胞等结构，中间呈现不规则的类圆形腔隙。免疫组化检测显示ANGs纵切面上laminin染色阳性，均匀分布；S-100β染色阴性。组织工程神经培养7 d时，免疫组化检测显示纵切面可见大量的GC染色阳性细胞，沿注射部分细胞向远端迁移，GC染色阳性细胞主要集聚在注射部位，靠近远端逐渐减少。B、C组的GC阳性细胞数明显多于A、D、组，差异存在统计学意义（P＜0.05）；B组与C组之间无统计学差异（P＞0.05）。培养14 d时，组织工程神经纵切面上可见大量的GC阳性细胞，分布较培养7 d时更为均匀，聚集在注射部位的细胞向远端迁移分布。B、C组的GC阳性细胞数较A、D、E组的更多，差异具有统计学意义（P＜0.05），而B组与C组之间无显著性差异（P＞0.05）。培养14 d时的GC阳性细胞数较培养7 d时的有所增加，但两者差异无统计学意义（P＞0.05）。光镜下除胫神经组外，其余两组的淋巴细胞数量均较少，蓝色淋巴细胞浸润数量相差不大。B组组织工程神经（培养14 d）与同种异体神经之间差异无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：脱细胞神经支架复合源于NSCs的少突胶质细胞构建的长段组织工程神经，具有接近正常神经的空间三维管道结构和细胞构成，免疫源性低，组织相容性及细胞粘附性较好，可能成为有效的神经替代材料。

目录

前言

参考文献

第一部分：1,25(OH)2D3诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化的研究

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂及其配制

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 NSCs的培养、传代与鉴定

2 诱导NSCs向少突胶质细胞分化

3分化细胞的培养、纯化与鉴定

4 分化细胞的冻存与复苏

讨论

1 少突胶质细胞在周围神经缺损修复中的作用

2不同诱导剂诱导向少突胶质细胞分化的作用

3少突胶质细胞的来源

小结

参考文献

附图 第一部分

第二部分：脱细胞神经支架复合神经干细胞来源的少突胶质细胞构建长段组织工程神经的研究

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 ANGs的物理性状

2 HE染色

3 透射电镜

4 免疫组化

5 组织工程神经皮下包埋

讨论

1 ANGs的制备及其在周围神经缺损修复中的作用

2 NSCs来源的少突胶质细胞的特性及应用

3 ANGs复合少突胶质细胞在周围神经缺损修复中的意义

小结

参考文献

附图 第二部分

全文总结

英汉缩略词对照表

致谢

综述:脱细胞神经支架在周围神经缺损修复中的研究进展

研究生在读期间主要研究成果

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