双sgRNA/Cas9介导基因精确删除阳性细胞富集系统的开发及应用研究

目录

声明

主要符号对照表

第一章 CRISPR/Cas9 介导基因敲除研究进展

1.1 基因组编辑技术

1.2 CRISPR/Cas 技术

1.2.1 CRISPR/Cas简介

1.2.2 CRISPR/Cas9技术的开发与应用

1.3 DNA双链断裂的修复机制

1.3.1 NHEJ 介导的双链断裂修复

1.3.2 HDR介导的双链断裂修复

1.4 NHEJ 介导的基因敲除

1.4.1 单sgRNA介导的基因敲除

1.4.2 双sgRNA介导的基因敲除

1.5 基因组的精确删除研究

1.5.1 HDR介导的基因组精确删除

1.5.2 NHEJ 介导的基因组精确删除

1.6 筛选富集基因编辑细胞的策略

1.6.1 筛选转染阳性的细胞

1.6.2 筛选核酸酶活性的细胞

1.6.3 筛选富集HDR修复细胞的策略

1.6.4 筛选富集NHEJ 修复细胞的策略

1.7.1 lncRNA概述

1.7.2 CRISPR/Cas9介导的lncRNA敲除研究

1.8 基因组编辑在畜牧业中的应用

1.9本研究的目的意义

第二章 CRISPR/Cas9 和双sgRNAs 介导精确删除细胞富集系统的建立

2.1 试验材料

2.1.1 试验菌种、质粒及细胞系

2.1.2 主要试剂及仪器

2.1.3 引物

2.2 试验方法

2.2.1 AAVS1位点打靶载体的构建

2.2.2 细胞培养、转染及流式细胞分选

2.2.3 细胞基因组删除效率检测

2.2.4 精确NHEJ报告系统（acNHEJ-USR）的构建

2.2.5 acNHEJ-USR报告系统活性鉴定

2.3.1 AAVS1位点打靶载体的构建

2.3.2 流式细胞分选后AAVS1位点精确删除检测

2.3.3 精确NHEJ报告系统（acNHEJ-USR）的构建

2.3.4 acNHEJ-USR报告系统活性鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 acNHEJ-USR 报告系统介导基因长片段精确删除在HEK293T细胞中的应用

3.1 试验材料

3.1.1 试验菌种、质粒及细胞系

3.1.2 主要试剂和仪器

3.1.3 引物

3.2 试验方法

3.2.1 AAVS1基因位点打靶载体的构建

3.2.2 EMX1基因位点打靶载体的构建

3.2.3 CCR5基因位点打靶载体的构建

3.2.4 细胞培养、转染及嘌呤霉素筛选

3.2.5 比较acNHEJ-USR筛选富集后的长片段精确删除效率

3.3 试验结果

3.3.1 AAVS1基因位点打靶载体的鉴定

3.3.2 EMX1基因位点打靶载体的鉴定

3.3.3 CCR5基因位点打靶载体的鉴定

3.3.4 比较acNHEJ-USR筛选富集后的长片段精确删除效率

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 acNHEJ-USR 在精确删除猪lncRNA中的应用

4.1 试验材料

4.1.1 试验菌种、质粒及细胞系

4.1.2主要试剂和仪器

4.1.3 引物

4.2 试验方法

4.2.1 猪lnc-sscg3623基因扩增及组织差异分析

4.2.2 lnc-sscg3623基因位点打靶载体的构建

4.2.3 细胞培养、转染及嘌呤霉素筛选

4.2.4 PK15细胞长片段精确删除阳性单克隆的挑取与鉴定

4.3 试验结果

4.3.1 猪lnc-sscg3623基因扩增及组织差异分析

4.3.2 lnc-sscg3623基因位点打靶载体的鉴定

4.3.3 PK15细胞lncRNA精确删除阳性单克隆的挑取与鉴定

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 lnc-sscg3623精确删除后的转录组测序、分析及功能研究

5.1 试验材料

5.1.1 试验菌种、质粒及细胞系

5.1.2 主要试剂和仪器

5.1.3 引物

5.2 试验方法

5.2.1 lnc-sscg3623敲除细胞单克隆转录组测序

5.2.2 差异表达的mRNA的筛选与鉴定

5.2.3 猪脂肪原代细胞的分离、培养及诱导分化

5.2.4 lncRNA的核质分离定位

5.2.5 lncRNA超表达载体的构建

5.3 试验结果

5.3.1 基因的总体表达水平分析

5.3.2 差异基因表达分析

5.3.3 候选差异基因qPCR验证

5.3.4 过表达lnc-sscg3623后候选基因的定量验证

5.3.5 lnc-sscg3623靶基因的预测

5.3.6 lnc-sscg3623抑制脂肪细胞的分化

5.4 讨论

5.5 小结

结论与创新点

不足之处及下一步研究计划

参考文献

致谢

个人简历