转基因水稻种子可培养内生微生物变异分析

摘要

随着转基因作物种植种类和种植面积的增加，转基因作物的安全性问题引起了广泛关注。水稻是全球最重要的粮食作物之一，对转基因水稻的非预期性变异评估是转基因水稻安全性评价的一项重要内容。内生微生物包括定殖在健康植物体内的内生细菌和真菌，转基因水稻种子内生菌菌群分布和结构的变异可能影响其食品和生态安全性。　　我们以转2mG2-epsps基因水稻为材料，比较分析了日本晴、D349和观283个品系转基因和非转基因水稻种子内生细菌菌群的分布差异，并监测了两种储藏条件下日本晴和D349品系转基因和非转基因水稻种子的可培养内生真菌菌群的分布差异和随储藏时间增长的动态变化，还筛选出了一对适用于水稻种子内生细菌PCR的高通量引物，从宏基因组层面对日本晴水稻种子内生细菌的菌群结构进行了分析。主要结果如下:　　(1)水稻种子内生细菌的检出存在很大的不稳定性，重复检测15次后水稻种子可分离内生细菌的菌群种类才能达到稳定。从所有水稻种子样本中分离出7个类群的内生细菌，代表菌株经鉴定分别Pantoea、Pseudomonas、Leucobacter、Enterobacter、Bacillus、Bactirum、Microbacterium，其中亲本水稻种子优势菌属为B1(Pantoea)和B5(Bacillus)。比较三个水稻品系发现，不同品系水稻种子内生细菌的定殖受2mG2-epsps基因的影响有较大的差异。P1和P3品系水稻种子内生细菌的定殖数量的增加受2mG2-epsps基因插入的影响较大，而P2水稻种子内生细菌的定殖数量受组织培养的影响较大;基因插入增加了B2(Pseudomonas)在种子水稻种子中的定殖，并使B1(Pantoea)在P3中定殖显著增加，而P2品系水稻种子中B1(Pantoea)的定殖主要受到组织培养效应的影响，使其定殖量显著增加，基因插入和组织培养显著抑制了B5(Bacillus)在P3品系种子中的定殖量。　　(2)以3个品系转基水稻种子利用PTN系统追溯GM水稻种子内生细菌定殖量变异的来源，发现P1品系GM水稻种子可培养真菌变异可能主要受到基因插入和转基因过程中的组织培养的影响不同，而P2和P3品系GM水稻种子可培养真菌变异可能主要受到转基因过程中的组织培养的影响，受基因插入影响较小。　　(3)采用传统分离培养方法跟踪监测了日本晴P1和D349 P2两个品系在室温和4℃储藏条件下转基因与其非转基因水稻种子可培养内生真菌的菌群随时间的变化。从水稻种子中共分离出47株内生真菌，归为22个属，47个种，优势类群是Dendryphiella、Curvularia和Fusarium，相对分离频率分别为59.01％、15.51％和8.16％。比较两种储藏条件发现，4℃储藏条件下水稻种子中的带菌率和种类数均高于室温条件，4℃储藏条件更能维持水稻种子中真菌的活性。比较两个水稻品系发现，2mG2-epsps基因插入从总体上增加了水稻种子内生真菌的定殖量和种类数，使其带菌率升高;随着种子储藏时间的增长，转基因和非转基因水稻种子的带菌率和检出种类均呈下降趋势，P1品系转基因和非转基因的相似度逐渐上升，P2品系的相似度逐渐下降，不同品系水稻内生真菌的定殖受2mG2-epsps基因的影响程度有较大差异。　　(4)7对高通量测序细菌PCR引物的引物序列通过blast同源性比对和与水稻基因组的Primer-blast比对，以及高通量测序验证，发现引物对Pr7（fM1和rC1）更适合作为水稻种子内生细菌的引物用于高通量PCR扩增，能减少水稻细胞器基因的干扰。应用引物Pr7进行的Illumina MiSeq高通量测序的结果分析日本晴种子内生细菌菌群结构，将日本晴水稻种子内生细菌类群归为62个OTU，分为6个门，10个纲，17个目，23个科，37个属，优势菌为泛菌属(Pantoea)、Candidatus Kuenenia属和乳球菌属（Lactococcus），占比分别为3.19％、0.09％和0.06％。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 转基因水稻的研究进展

1．1．1 抗虫转基因水稻培育

1．1．2 抗病基因工程研究

1．1．3 抗除草剂转基因水稻研究

1．1．4 水稻抗逆基因工程研究

1．1．5 利用转基因水稻工程在制备药物和次级代谢工程中的应用

1．2 转基因水稻安全性评估研究进展

1．2．1 转基因水稻营养成分评估

1．2．2 转基因水稻非期望效应评估

1．2．3 转基因对水稻内生菌的影响

1．3 植物内生菌的研究方法

1．3．1 传统分离培养法

1．3．2 分子生物学技术研究法

1．4 研究意义和目的

第2章 转基因水稻种子可培养内生细菌菌群变异分析

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 水稻材料

2．2．2 主要试剂与仪器

2．3 实验方法

2．3．1 水稻内生菌的分离

2．3．2 水稻种子内生菌的鉴定

2．3．3 水稻种子可培养变异内生细菌的耐热研究

2．3．4 数据处理及统计分析

2．4 结果与分析

2．4．1 检测次数对分离效果的影响

2．4．2 水稻种子可培养内生细菌的形态学观察

2．4．3 水稻种子可培养内生细菌16S rRNA鉴定结果

2．4．4 GM水稻及其多重对照样本的种子可培养内生菌群变异分析

2．4．5 水稻可培养部分变异内生细菌的耐热

2．5 讨论

第3章 抗草甘膦转基因水稻种子可培养内生真菌多样性变异分析

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 培养基

3．2．3 水稻种子内生真菌的分离及纯化

3．2．4 内生真菌的鉴定

3．2．5 数据处理与统计分析

3．3 结果分析

3．3．1 水稻种子可培养内生真菌的组成

3．3．2 转基因水稻及其多重对照样本的种子可培养内生真菌类群的比较

3．3．3 转基因水稻与多重对照样本的种子可培养内生真菌的多样性比较分析

3．4 讨论

第4章 转基因水稻种子可培养内生真菌菌群变异及其存储变化动态分析

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 培养基

4．2．3 水稻种子内生真菌的分离及纯化

4．2．4 内生真菌的鉴定

4．2．5 数据处理与统计分析

4．3 结果分析

4．3．1 水稻种子可培养内生真菌的组成

4．3．2 GM水稻种子可培养内生真菌多样性随储藏时间的变化动态分析

4．3．3 储藏一年前后GM水稻种子可培养真菌随的变化分析

4．3．4 5种优势内生真菌在GM水稻种子中的分离率变化动态分析

4．4 讨论

第5章 水稻种子内生细菌高通量测序PCR引物的筛选和菌群结构分析

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 水稻材料

5．2．2 主要试剂

5．3．1 引物的初筛

5．3．2 水稻种子表面消毒

5．3．3 水稻种子基因组提取

5．3．4 水稻种子内生细菌16S rRNA基因序列的PCR扩增

5．3．5 DNA纯化

5．3．6 上机测序

5．3．7 数据处理

5．4 结果与分析

5．4．1 候选引物的同源性比对和初步筛选

5．4．2 水稻种子内生微生物全DNA提取和16S rRNA基因序列的PCR扩增

5．4．3 初筛引物对用于水稻种子内生细菌16S rRNA基因序列的高通量测序实验验证

5．4．4 基于高通量测序日本晴种子内生细菌菌群结构分析

5．5 讨论

第6章 总结与展望

6．1 总结

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

致谢

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