凹凸棒石负载姜精油复合物的表征及抗菌活性研究

摘要

本论文首先研究了姜精油超临界CO2萃取技术提取工艺的优化，通过单因素、响应面优化方法得到了最佳的姜精油提取工艺。然后用活化的凹凸棒石作为载体，结合出一种新型凹凸棒石负载姜精油复合物;并对该复合物的表征开展了研究;最后，通过体内、体外抗菌实验证实了该复合物对大肠杆菌的抑制作用，并在分子水平研究了其抑菌抗炎作用机理。
　　(1)姜精油的提取。应用超临界CO2萃取技术提取姜精油，采取单因素和响应面优化方法，以6-姜酚得率作为姜精油提取的考察指标，在本实验室前期研究基础上，又考察了CO2流量、姜粉过筛目数和夹带剂（无水乙醇）添加量三个因素对萃取效果的影响。所得最优姜精油提取条件为:CO2流量为25L/h，姜粉过筛目数为80目，夹带剂添加量为无水乙醇92.46mL，得到的6-姜酚的最优得率为3.21％。
　　(2)凹凸棒石负载姜精油复合物的表征。通过傅里叶红外光谱仪(FTIR)、X射线衍射仪(XRD)、同步热分析仪(TG-DSC)、Zeta电位仪、比表面积及孔径分析仪(BET)、场发射透射电子显微镜(TEM)对凹凸棒石负载姜精油复合物进行了表征。FTIR结果显示凹凸棒石已负载了姜精油。XRD和BET结果显示姜精油以物理吸附的方式附着于凹凸棒石表面。TG-DSC分析进一步证明了凹凸棒石负载姜精油，并估算该复合物中姜精油含量为13.97％。复合物的Zeta电位绝对值较单一的凹凸棒石明显降低。TEM观察结果表明姜精油进入了凹凸棒石颗粒的微观孔道，与其成功结合。
　　(3)凹凸棒石负载姜精油复合物体外抑菌活性的研究。该复合物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为25mg·mL-1，与单一的姜精油相比表现出更好的抗菌活性。该复合物对延缓期和对数期生长的大肠杆菌均表现出较强的抑制效果。革兰氏染色实验和吸附性实验结果表明，该复合物很好的结合了凹凸棒石吸附细菌的性能和姜精油的抗菌活性，具有良好的靶向抗菌活性。同时姜精油以凹凸棒石作为载体，所得复合物的抗菌稳定性明显增强，其耐热性、耐候性明显提高。
　　(4)凹凸棒石负载姜精油复合物体内抗菌活性的研究。成功建立了小鼠体内感染大肠杆菌致腹泻动物模型。通过测定小鼠体重、饮水量、摄食量、腹泻率、临床症状评分以及小肠病理组织学观察，结果表明，腹泻动物灌胃凹凸棒石负载姜精油复合物后，体重、饮水量和摄食量明显恢复;腹泻等临床症状明显缓解;受损的肠道组织明显改善。说明该复合物对大肠杆菌所致肠道感染症状具有改善作用;且相对于单一的姜精油和凹凸棒石，复合物具有改善效果佳、起效时间短的特点。
　　(5)凹凸棒石负载姜精油复合物抗大肠杆菌感染作用的分子机理研究。分析小鼠肠道感染大肠杆菌后以及经凹凸棒石负载姜精油复合物干预后，小肠组织中相关炎性因子的基因表达。大肠杆菌感染小鼠小肠组织中炎症因子Toll样受体2(TLR-2)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达量明显上升，该复合物干预后上述炎性因子基因表达量明显降低;显示该复合物可能通过下调炎症因子(TLR-2，IL-6，IL-8，TNF-α)的基因表达，从而抑制大肠杆菌感染导致的肠道炎症。
　　综上所述，本研究进一步优化了姜精油的提取工艺，并成功地将姜精油与凹凸棒石复合，研发出一种新型的天然抗菌复合物;通过一系列表征研究证明了二者的结合。体内外抗菌实验研究表明，该复合物对大肠杆菌具有显著的抗菌作用，可改善大肠杆菌感染引起的动物肠道炎症和肠道功能紊乱。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 天然抗菌剂

1．2．1 植物类天然抗菌剂

1．2．2 动物类天然抗菌剂

1．2．3 微生物类天然抗菌剂

1．2．4 矿石类天然抗菌剂

1．3 姜精油的特性及功能

1．3．1 姜精油的基本特性

1．3．2 姜精油的功能

1．3．3 姜精油的提取方法研究

1．4 凹凸棒石的特征研究

1．4．1 凹凸棒石的晶体结构特征

1．4．2 凹凸棒石的应用研究

1．5 研究意义及研究内容

第二章 姜精油的提取工艺研究

2．1 材料、试剂与仪器

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验试剂

2．1．3 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 提取方法

2．2．2 萃取时间、压力和温度最优萃取条件

2．2．3 高效液相色谱(HPLC)检测条件

2．2．4 单因素试验

2．2．5 响应面优化试验(RSM)

2．2．6 验证试验

2．3 结果与分析

2．3．1 单因素试验结果

2．3．2 响应面优化试验结果

2．4 小结与讨论

第三章 凹凸棒石负载姜精油复合物的表征与性质分析

3．1 实验材料、试剂与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 仪器与设备

3．2 凹凸棒石负载姜精油复合物的制备

3．3 试验方法

3．4 实验结果

3．4．1 红外光谱(FTIR)分析

3．4．2 X射线衍射(XRD)分析

3．4．3 热重和示差扫描量热(TG-DSC)分析

3．4．4 Zeta电位、比表面积及孔径(BET)分析

3．4．5 场发射透射电子显微镜(TEM)分析

3．5 小结与讨论

第四章 凹凸棒石负载姜精油复合物的体外抗菌活性研究

4．1 试验材料

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基

4．1．3 药品与试剂

4．1．4 仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 最小抑菌浓度(MIC)的测定

4．2．2 凹凸棒石负载姜精油复合物对大肠杆菌生长曲线的影响

4．2．3 革兰氏染色分析

4．2．4 大肠杆菌吸附性的影响

4．2．5 耐热性

4．2．6 耐候性

4．3 结果与分析

4．3．1 最小抑菌浓度(MIC)

4．3．2 生长曲线

4．3．3 大肠杆菌的的革兰氏染色分析

4．3．4 凹凸棒石负载姜精油复合物对大肠杆菌的吸附性实验

4．3．5 耐热性

4．3．6 耐候性

4．4 小结与讨论

第五章 凹凸棒石负载姜精油复合物的体内抗菌活性研究

5．1 材料

5．1．1 试验动物与菌种

5．1．2 药品

5．1．3 试剂

5．1．4 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 菌悬液的制备

5．2．2 大肠杆菌感染致腹泻动物模型的建立

5．2．3 实验分组

5．2．4 体重

5．2．5 饮水量、摄食量

5．2．6 临床症状评分

5．2．7 腹泻率检测

5．2．8 病理组织形态学观察

5．3 统计学处理

5．4 体内抗菌实验结果

5．4．1 小鼠体重变化

5．4．2 饮水量、摄食量变化

5．4．3 临床症状评分结果

5．4．4 腹泻率变化

5．4．5 病理组织形态学观察

5．5 小结与讨论

第六章 凹凸棒石负载姜精油复合物对肠道细菌感染作用的分子机理研究

6．1 材料、试剂与仪器

6．1．1 动物材料

6．1．2 试验试剂

6．1．3 仪器与设备

6．1．4 引物设计

6．2 试验方法

6．2．1 动物分组以及给药

6．2．2 RT-PCR法测定小鼠小肠组织中炎症因子的基因表达

6．2．3 统计学处理

6．3 结果与分析

6．3．1 Toll样受体-2(TLR-2)基因

6．3．2 白细胞介素8（interleukin8,IL-8)基因

6．3．3 白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)基因

6．3．4 肿瘤破坏因子α(TNF-α)基因

6．4 小结与讨论

第七章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文