Agromyces mediolanus环氧化物水解酶催化合成手性环氧化物的研究

摘要

手性苯基环氧乙烷(SO)和手性苄基缩水甘油醚(BGE)是合成很多药物的重要前体物。如(S)-SO可作为合成反苯环丙胺结构的原料，用于合成抗肿瘤，抗抑郁以及治疗急性冠脉综合征等药物。(R)-BGE是合成抗肿瘤药物SPIKET-P和番荔枝内酯的重要前体物，在抗白血病方面有着重要价值。(S)-BGE是很多免疫抑制剂的重要结构部分，可用于合成天然产物二乙酸隐花甘蓝。该药在治疗头痛，晨吐以及抗癌甚至在藻类信息素前体的合成等领域具有重要的研究价值。　　本文根据文献报道，合成了Agromyces mediolanus环氧化物水解酶(EH-Am)的基因序列，并将此基因导入大肠杆菌质粒中进行表达。通过单因素优化，得出最优表达条件:诱导剂浓度为0.2mM，诱导温度为28℃，诱导时间为8h。对EH-Am的酶学性质进行了研究，结果发现，此酶的最适pH为8.0，最适反应温度为35℃。温度稳定性结果显示，30℃时的半衰期为51.14h，而50℃的半衰期为4.74h。　　首先，利用EH-Am拆分外消旋SO制备手性SO。结果显示，当底物浓度为1.06mM，反应10h后(R)-SO的ee值＞99％，收率为25％。对两个构型底物之间的相互抑制以及产物抑制进行了研究，结果表明，(S)-SO能显著抑制(R)-SO的水解，(S)-SO的水解产物产物(S)-1-苯基-1，2-乙二醇对(S)-SO水解存在较强抑制。底物浓度研究结果显示，当SO浓度大于2.11mM时，(R)-SO的ee值较低。通过底物补加的方式，(R)-SO的收率由24.8％提高到33.2％（底物浓度2.11mM）;向反应体系中加入一定量的吐温20表面活性剂，(R)-SO的收率则提高到34.2％。　　接着利用EH-Am拆分外消旋BGE制备手性BGE。结果显示，当底物浓度为6.72mM，反应6h后(S)-BGE的ee值＞99％，收率为34％。对两个构型底物之间的相互抑制以及产物抑制进行了研究，结果表明(R)-BGE能显著抑制(S)-BGE的水解，(R)-BGE的水解产物产物(R)-3-苄基-1，2-丙二醇对(R)-BGE水解存在较强抑制。底物浓度对(S)-BGE的ee值和产率有显著影响，当底物浓度为0.672mM时，(S)-BGE的ee值＞99％，收率达40.1％。随着底物浓度的提高，(S)-BGE的收率逐渐下降。当外消旋BGE浓度为10.75mM时，(S)-BGE的收率只有21.2％;若继续提高底物浓度，(S)-BGE的ee值则达不到99％。通过底物补加的方式，当浓度为10.75mM时，(S)-BGE的收率为由原来的21.2％提高到26.9％;在反应体系加入一定量的表面活性剂TritonX-100，(S)-BGE的收率则提高到35.9％。

目录

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摘要

第一章绪论

1．1手性环氧化物概述

1．1．1手性化合物的概述

1．1．2重要的手性化合物一手性环氧化物

1．2手性环氧化物合成方法

1．2．1化学法

1．2．2生物法

1．3环氧化物水解酶概述

1．3．1环氧化水解酶的类型

1．3．2环氧化物水解酶的作用原理

1．3．3环氧化物水解酶的应用

1．4本文的研究内容

第二章Agromyces mediolanus环氧化物水解酶基因工程菌的构建、条件优化及酶学性质研究

2．1引言

2．2材料与方法

2．2．1实验试剂

2．2．2菌种与质粒

2．2．3实验仪器

2．2．4表达载体构建

2．2．5大肠杆菌感受态制备

2．2．6重组质粒的转化

2．2．7重组菌的筛选及鉴定

2．2．8基因的诱导表达

2．2．9酶活检测

2．2．10重组大肠杆菌生长曲线测定

2．2．11诱导条件优化

2．2．12酶的分离纯化

2．2．13酶学性质硼究

2．2．14分析方法

2．3结果与讨论

2．3．1重组菌的构建

2．3．2重组大肠杆菌活力测定

2．3．3重组菌生长曲线测定

2．3．4诱导剂浓度对菌体生长和产酶的影响

2．3．5诱导温度对菌体生长和产酶的影响

2．3．6诱导时间对菌体生长和产酶的影响

2．3．7菌体的分离纯化

2．3．8反应pH对酶活的影响

2．3．9反应温度对酶活的影响

2．3．10酶热稳定性研究

2．4本章小结

第三章环氧化物水解酶EH-Am催化合成(R)-苯基环氧乙烷

3．1引言

3．2材料与方法

3．2．1实验材料

3．2．2酶催化外消旋SO的不对称水解

3．2．3酶活和比酶活的定义

3．2．4分析方法

3．3结果与讨论

3．3．1外消旋SO的反应进程

3．3．2动力学参数的确定

3．3．3(R)-SO和(S)-SO与酶的模拟对接

3．3．4(R)-SO和(S)-SO相互抑制研究

3．3．5产物浓度对外消旋SO不对称水解的影响

3．3．6底物浓度对生产(R)-SO的影响

3．3．7通过底物补加合成(R)-SO

3．3．8表面活性剂在生产(R)-SO中的研究

3．4本章小结

第四章环氧化物水解酶EH-Am催化合成(S)-苄基缩水甘油醚

4．1引言

4．2材料与方法

4．2．1实验材料

4．2．2酶催化外消旋BGE的不对称水解

4．2．3酶活和比酶活的定义

4．2．4分析方法

4．3结果与讨论

4．3．1外消旋BGE的反应进程

4．3．2动力学参数的确定

4．3．3(R)-BGE和(S)-BGE与EH-Am的分子对接

4．3．4(R)-BGE和(S)-BGE相互抑制动力学

4．3．5产物浓度对BGE不对称水解的影响

4．3．6底物浓度对EH-Am催化合成(S)-BGE的影响

4．3．8表面活性剂对EH-Am催化合成(S)-BGE的影响

4．4本章小结

5．1结论

5．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果