小黄鱼17β-雌二醇浸浴及光照、声音应激刺激的影响研究

摘要

小黄鱼（Larimichthys polyactis）是我国重要的海洋经济鱼类之一，目前小黄鱼的全人工繁育已取得成功，人工养殖发现，雌鱼体形大于雄鱼，全雌化养殖具有更高的经济效益；同时小黄鱼也表现出应激反应较强的现象，导致个体较易受伤或死亡。本研究选择不同浓度的17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）对小黄鱼幼鱼进行浸浴处理；以及对应激反应系统中交感—嗜铬组织系统的产物肾上腺激素合成步骤的关键酶多巴胺-β-羟化酶（ dopamine-beta-hydroxylase， DBH）和苯乙胺-N-甲基转移酶（phenylethanolamine N-methyl transferase，PNMT）基因进行生物信息学分析，并对小黄鱼在声音、光照的应激处理下，对小黄鱼dbh和pnmt基因在脑和肾的表达情况进行研究。本研究的主要结果包括：　　1.在20-60dat（处理后天数，days after treatment）时，E2浸浴实验组在体长和体重上均显著低于对照组，60dat时，GSI（Gonadosomatic index）水平E2浸浴实验组和雌性对照组C（0）相比无显著性差异。解剖学及组织观察学表明，E2浸浴实验组1μg/L与10μg/L性腺头端粗短，出现二时相至三时相卵母细胞，且有明显卵巢腔，50μg/L组部分性腺发育畸形。当E2浓度达到10μg/L以上时，未发现雄性及未分化性腺，且随着浓度的上升，出现畸形的比率上升。E2浸浴组雌性率分别82%，88%，63%，对照组性比近似1：1。　　2.从小黄鱼全基因组中通过拼接及鉴定，确定出1个dbh和2个pnmt基因（pnmt a，pnmt b），dbh基因包含12个外显子，全长10865bp（碱基），编码区共1859bp，蛋白序列共605aa（氨基酸），pnmt a包含3个外显子，pnmt a基因全长2056bp，编码区共822bp，共翻译273aa，pnmt b包含3个外显子，pnmt b基因全长2908bp，编码区共543bp，共翻译180aa，氨基酸序列与鱼类相比，同源性大于65%，通过进化树的构建，发现大黄鱼（Larimichthys crocea）与其的亲缘关系最为接近。从转录组数据中得知，dbh基因在肠、脑、肾、头肾、精巢组织中表达，在皮肤、腮、眼、卵巢、脾组织中微量表达。pnmt a基因在脑、肾和头肾组织中高量表达，在肠、皮肤、脑、腮、精巢中微量表达，pnmt b在肠、皮肤、腮、脑、肾、头肾、精巢中表达和在肝、眼、心、脾中微量表达。　　3.通过检测pnmt a、pnmt b和dbh在不同时间15s、90s和300s刺激下脑与肾脏组织中的表达情况，结果表明在光照刺激脑组织中，300s组pnmt a和dbh基因表达量在实验同组中表达最高，90s组pnmt b基因的表达量在实验同组中表达量最高。在肾组织中，300s组的pnmt a、b和dbh基因表达量在实验同组中表达最高。在声音刺激的脑组织中，300s组的pnmt a、b和dbh基因表达量在实验同组中表达最高，在肾组织中，15s组pnmt a基因表达量在同组中最高，300s组pnmt b、dbh基因表达量在同组中最高。光照和声音的刺激，激发了小黄鱼“交感-嗜铬组织”系统，可以导致小黄鱼dbh和pnmta、b基因的表达上调，且随着时间的延长，表达量会升高。　　本研究用不同浓度雌激素 E2诱导小黄鱼幼鱼，当 E2浓度为10μg/L时，诱导效果最好，主要表现在雌性率最高，为研究小黄鱼性别分化的机制以及全雌化育种的可能奠定理论基础。对小黄鱼dbh和pnmt基因进行生物信息学分析，发现dbh和pnmt基因和大黄鱼的亲缘关系最近，pnmt基因可能存在一个复制基因；在声音、光照的应激处理下，发现小黄鱼dbh和pnmt基因在脑和肾组织中的基因表达均会上调，为进一步研究鱼类的应激反应机制奠定了基础。

目录

声明

第一章 文献综述1

1.1 鱼类性别分化

1.1.1 遗传型性别决定

1.1.2 环境型性别决定

1.1.3 性控育种

1.2鱼类应激的影响研究进展

1.2.1 鱼类应激的生理过程

1.2.2 应激激素对鱼体的影响

1.2.3 应激基因相关研究

1.3 本研究的目的与意义

第二章 17β-雌二醇浸浴对小黄鱼幼鱼生长及性腺发育的影响

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验设计及样品处理

2.1.3 组织切片观察

2.1.4 H.E（苏木精－伊红）染色

2.1.5 数据分析

2.2 实验结果

2.2.1 E2 浸浴对小黄鱼早期生长的影响

2.2.2 E2 浸浴对小黄鱼性腺及性腺成熟系数的影响

2.2.3 E2 浸浴小黄鱼性腺组织学观察

3.1 讨论

3.1.1 雌激素E2抑制小黄鱼的生长

3.1.2 雌激素E2可诱导小黄鱼雌性化

3.1.3 乙醇抑制小黄鱼性腺的发育

第三章 小黄鱼dbh和pnmt基因的生物信息学及组织表达分析

3.1 材料与方法

3.1.1 基因数据的获取

3.1.2 基因数据的分析与比对

3.2 结果

3.2.1 小黄鱼dbh和pnmt的基因鉴定与分析

3.2.2 小黄鱼dbh和pnmt的氨基酸同源性分析及结构域预测

3.2.3 小黄鱼dbh和pnmt的蛋白功能预测

3.2.4 小黄鱼dbh和pnmt的系统进化树

3.2.5 小黄鱼dbh和pnmt基因在转录组中的组织表达

3.3 讨论

3.3.1 小黄鱼dbh和pnmt基因的分子结构及功能分析

3.3.2 小黄鱼dbh和pnmt基因的进化树分析

第四章 光照和声音刺激对小黄鱼pnmt和dbh基因表达的影响

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验设计及样品处理

4.1.3 引物设计

4.1.4 样品的RNA提取

4.1.5 第一链cDNA的合成

4.1.6 qRT-PCR

4.2 实验结果

4.2.1 光照刺激对小黄鱼dbh和pnmt的表达分析

4.2.2 声音刺激对小黄鱼dbh和pnmt的表达分析

4.3 讨论

4.3.1 光照、声音刺激对小黄鱼的应激影响

总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果