免疫接头蛋白Skap1和Fyb双基因敲除小鼠模型的建立及SKAP1相互作用蛋白的鉴定

摘要

接头蛋白是一类缺乏转录活性和酶活性的分子，但其含有对蛋白质结合和构成信号复合物所需的蛋白质间互作的结构域。SKAP1和FYB1是一对主要在T细胞和免疫细胞中表达的功能相关的接头蛋白，并且FYN-SKAP1分子模块在“inside-out”信号通路中作为整合素激活的调控因子来介导T细胞粘附。　　FYB1结合并维持SKAP1的表达，在细胞系和动物模型中，FYB1的敲除会导致SKAP1蛋白的显著性降解。在由整合素激活而引起的T细胞粘附中FYB1和SKAP1的功能性存在很大的重叠性，Fyb和Skap1单基因敲除的小鼠已经产生并广泛应用于研究，Fyb和Skap1双基因敲除小鼠有利于对FYB-SKAP1分子模块在TCR介导的整合素激活进行功能性评估，但Fyb和Skap1双基因敲除小鼠还未有报导。本研究的主要目标是利用Fyb和Skap1单基因敲除的小鼠进行一系列的交配，最终培育出Skap1和Fyb的双基因敲除小鼠模型。此外，为鉴定与SKAP1互作的分子，使用免疫共沉淀法得到Jurkat细胞中与SKAP1结合的蛋白，再使用液相色谱串联质谱法进行分析。　　结果:获得了基因型能稳定遗传的Fyb和Skap1双基因敲除小鼠，在DNA水平，用特异引物通过PCR对小鼠的基因型进行鉴定，在蛋白表达水平，通过免疫印迹法孵育FYB1抗体对小鼠蛋白的表达进行鉴定。Fyb和Skap1双基因敲除小鼠及其子代小鼠和野生型或单基因敲除小鼠没有明显区别，也没有明显的免疫缺陷表型。质谱结果经处理与分析，得到初步认定与SKAP1蛋白相互作用或与其构成蛋白复合体的蛋白质共46个。　　结论:本研究获得了基因型能稳定遗传的Fyb和Skap1双基因敲除小鼠，为后续的Fyb单基因敲除小鼠与Skap1和Fyb双基因敲除小鼠的差异研究打下了重要的基础。本研究鉴定得到的初步认定与SKAP1蛋白相互作用或构成蛋白质复合体的蛋白质，为今后研究T细胞中与SKAP1互作的蛋白及SKAP1的功能打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文章综述

1．1 T细胞中的信号转导

1．1．1 免疫接头蛋白

1．1．2 接头蛋白FYB1

1．1．3 接头蛋白SKAP1

1．1．4 FYB1-SKAP1蛋白模块及在整合素介导的T细胞免疫粘附中的作用

1．2．1 胚胎干细胞

1．2．2 基因敲除小鼠

1．2．3 基因敲除小鼠的制备

1．3．1 蛋白质相互作用

1．3．2 免疫共沉淀

1．3．1 蛋白质多肽分子鉴定技术

1．4 研究进展

1．5 研究目的及意义

第二章 Skap1和Fyb双基因敲除小鼠的繁育

2．1 实验仪器和试剂

2．1．1 分子生物学试剂和耗材

2．1．2 实验动物

2．1．3仪器设备

2．2．1 小鼠基因型的鉴定

2．2．2 双基因敲除小鼠的配种及繁育

2．2．3 小鼠基因表达的鉴定

2．3．1 亲代小鼠基因型的鉴定

2．3．2 Fyb-/-Skap1+/+和Fyb+/+Skap1-/-小鼠杂交子代小鼠基因型的鉴定

2．3．3 Fyb+/-Skap1+/-与Fyb-/-Skap1+/+小鼠杂交子代小鼠基因型的鉴定

2．3．4 Fyb-/-Skap1+/-小鼠自交子代小鼠基因型的鉴定

2．3．5 Fyb-/-Skap1-/-小鼠自交子代小鼠基因型的鉴定

2．3．6 野生型、单基因敲除、双基因敲除小鼠基因表达的鉴定

2．4 讨论

第三章 T细胞中与SKAP1相互作用蛋白的鉴定

3．1 实验仪器和试剂

3．1．1 分子生物学试剂、细胞及耗材

3．1．2 器材和仪器设备

3．2 实验方法

3．3．2 SKAP1 Co-IP免疫印迹结果

3．3．3 SKAP1 Co-IP质谱鉴定结果

3．4 讨论

第四章 全文总结

参考文献

附录

作者简介

致谢