粒毛盘菌黑色素及其衍生物结构、生物活性与作用机制

摘要

本研究通过深层发酵获得粒毛盘菌YM30菌丝体，采用化学方法对菌丝体进行提取、纯化获得粒毛盘菌胞内黑色素LIM。采用紫外吸收光谱，红外光谱，元素分析，核磁共振谱及质谱等技术解析出LIM可能的结构。结果表明，LIM是一种真黑色素，具有羟基吲哚结构。
　　对LIM的抑菌活性进行研究。采用微孔稀释法检测LIM对大肠杆菌等革兰氏阴性菌和李斯特菌等革兰氏阳性菌的抑菌效果，结果表明LIM对测试菌株均有抑制，且对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌抑制效果较好。选择副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌两种菌株对LIM抗菌效果进行进一步探究，通过扫描电镜观察、细菌细胞膜通透性检测、N-苯基-1-萘胺(NPN)吸收和膜电位(MP)的检测得到以下结果:LIM可以影响细菌细胞膜通透性和完整性，增加细菌细胞内容物的泄漏量，提高NPN摄入量并降低细菌膜电位，并且低浓度LIM对肝癌细胞HepG2细胞无细胞毒性。以上结果表明，LIM具有抑菌活性，并可影响细菌的膜功能，可作为潜在的天然抑菌剂应用于食品工业或药物制备。
　　采用精氨酸对LIM进行修饰获得衍生物ALIM，采用红外、质谱对其结构进行验证，研究LIM、ALIM以及阳性药物+LIM联合治疗在脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)肝损伤小鼠模型中的抗炎保肝效果。结果显示，各处理组均显著降低血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肝脏核转录因子kappa B(NF-κB)水平，降低血清中肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)含量，并且显著降低了诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)及NO水平以及提高了白介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)的含量。结果表明，LIM与ALIM均有显著的抗炎保肝活性，阳性药物+LIM联合治疗相比于单一阳性药物治疗或黑色素治疗可进一步减轻模型药物对小鼠造成的机体损伤。因此，LIM和ALIM是潜在的肝损伤预防剂，可用于治疗LPS/GalN引起的肝损伤，阳性药物+LIM联合治疗也是减轻模型肝损伤的潜在治疗方式。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 黑色素来源

1．2 黑色素分类

1．3 黑色素的理化特性

1．3．1 空间结构特性

1．3．2 稳定性

1．3．3 溶解性

1．3．4 光吸收性

1．3．5 氧化还原性

1．3．6 阳离子螯合特性

1．3．7 光电导性和半导体性质

1．4 黑色素结构解析

1．4．1 紫外光谱技术

1．4．2 红外光谱技术

1．4．3 核磁共振技术

1．4．4 拉曼光谱

1．4．5 X-射线光电子能谱

1．4．6 电子顺磁共振

1．5 黑色素的生物功能与应用

1．5．1 黑色素的神经保护与再生功能

1．5．2 黑色素减缓疟疾病症

1．5．3 黑色素与药物结合

1．5．4 黑色素影像学应用

1．5．5 黑色素的DNA保护功能

1．5．6 黑色素的抗病毒功效

1．5．7 黑色素的抗辐射活性

1．6 粒毛盘菌及其黑色素研究概况

1．7 本课题研究的意义及内容

第二章 粒毛盘菌YM30胞内黑色素结构解析

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 菌株及材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 元素分析

2．3．2 紫外光谱

2．3．3 红外光谱

2．3．4 NMR核磁分析

2．3．5 质谱分析

2．4 结果与分析

2．4．1 LIM元素分析结果

2．4．2 LIM紫外光谱分析结果

2．4．3 LIM红外光谱分析结果

2．4．4 LIM 1H NMR分析结果

2．4．5 LIM 13C NMR分析结果

2．4．6 LIM质谱分析结果

2．5 讨论

2．6 本章小结

第三章 LIM的抑菌作用及其机制

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 粒毛盘菌黑色素

3．2．2 试剂及药品

3．2．3 仪器及设备

3．2．4 实验菌株

3．3 实验方法

3．3．1 培养基制备

3．3．2 麦氏比浊法

3．3．3 最小抑制浓度(MIC)

3．3．4 最小杀菌浓度(MBC)

3．3．5 扫描电子显微镜观察(SEM)

3．3．6 细菌细胞膜通透性实验

3．3．7 NPN摄取检测

3．3．8 膜电位(MP)检测

3．3．9 细胞毒性实验

3．3．10统计分析

3．4 结果与分析

3．4．1 麦氏比浊曲线

3．4．2 抗菌实验

3．4．3 扫描电镜观察

3．4．4 LIM对细菌细胞膜通透性的影响

3．4．5 LIM对细菌NPN摄取的影响

3．4．6 LIM对细菌膜电位的影响

3．4．7 LIM对HepG2细胞存活率的影响

3．5 讨论

3．6 总结

第四章 LIM及其衍生物的抗炎保肝活性

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 粒毛盘菌黑色素

4．2．2 试剂及药品

4．2．3 仪器及设备

4．3 实验方法

4．3．1 粒毛盘菌黑色素衍生物的制备

4．3．2 ALIM的结构验证

4．3．3 ALIM的溶解度测定

4．3．4 动物分组和实验设计

4．3．5 生化测定

4．3．6 Griess法测定NO含量

4．3．7 组织病理学检查

4．3．8 统计分析

4．4 结果与分析

4．4．1 ALIM的结构表征及溶解度

4．4．2 LIM和ALIM对小鼠血清ALT和AST含量的影响

4．4．3 LIM和ALIM对小鼠体重和器官指数的影响

4．4．4 LIM和ALIM对小鼠血清炎性因子的影响

4．4．5 LIM和ALIM对小鼠血清抗炎因子的影响

4．4．6 LIM和ALIM对小鼠血清iNOs和NO的影响

4．4．7 LIM和ALIM对小鼠肝脏NF-κB的影响

4．4．8 LIM和ALIM对肝脏显微结构变化的影响

4．5 讨论

4．6 本章小结

第五章 结论和展望

5．1 结论

5．2 展望

5．3 创新点

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及申报的专利