基于诱导应激的金属硫蛋白高效表达及分离纯化研究

摘要

本研究旨在缓解制约金属硫蛋白(metallothionein，MT)产业发展原料来源瓶颈，针对实验室构建的三株重组海洋源MT-益生菌菌株，采用多金属多途径联合诱导，获得MT高效表达的最佳途径，通过优化规模化重组工程菌发酵技术、多元集成膜联合层析技术，获得目标蛋白。重组海洋源MT-益生菌菌株的高安全性、高产量和高生产稳定性等特征，使海洋源MT具有极大的应用于实际工业生产的潜能，为天然高效重金属生物解毒剂的成功开发和推广提供理论依据。主要研究结果如下:　　1.在菌种摇瓶培育条件优化试验中得到结论:WB-800N培养基最佳初始pH为7，最佳培育转速为220 r/min，最佳接种量为4％; GS-115培养基最佳初始pH为9，最佳培育转速为240 r/min，最佳接种量为4％; SMD-1168培养基最佳初始pH为8，最佳培育转速为220 r/min，最佳接种量为4％。　　2.在菌种摇瓶诱导发酵条件优化试验中得到结论:WB-800N的最佳诱导OD600为4，最佳IPTG诱导剂终浓度为1 mmol/L，最佳诱导摇床转速为220 r/min，最佳诱导时间为48 h，最佳诱导金属为CdCl2，其终浓度为50μmol/L，MT表达量达到峰值0.135 mg/mL; GS-115最佳诱导OD600为9.7，最佳甲醇诱导剂终浓度为5％，最佳诱导摇床转速为220 r/min，最佳诱导时间为24 h，最佳诱导金属为CuCl2，其终浓度为50μmol/L，MT表达量达到峰值0.328 mg/mL; SMD-1168最佳诱导OD600为8.8，最佳甲醇诱导剂终浓度为7.5％，最佳诱导摇床转速为240r/min，最佳诱导时间为48 h，最佳诱导金属为CuCl2，其终浓度为500μmol/L，MT表达量达到峰值0.202 mg/ml。　　3.通过对发酵罐培育技术的摸索，对毕赤酵母菌GS-115进行了发酵罐放大培育发酵测验，结果显示Cu-MT的表达量达0.292 mg/mL，与摇瓶条件中表达量相似。　　4.通过对发酵液中Cu-MT对高温、酸和乙醇的稳定性试验以及平板膜超滤试验，得到发酵液前处理方法为:80℃条件下保温10 min，于常温，8000 r/min条件下离心20 min，取上清液4℃保存，后经5kD和50kD的硝酸纤维膜超滤得到Cu-MT浓缩液;浓缩液中Cu-MT浓度为1.774 mg/mL，总蛋白含量为59.52％，总糖含量为9.23％。　　5.在对预处理后的Cu-MT浓缩液离子交换层析条件优化中，得到结论:最佳pH值为8.5，样液浓度为0.6 mg/mL，上样流速为1.0 BV/h，解吸剂浓度为含0.6 mol/LNaCl的10 mmol/Tris-HCl(pH=8.5)溶液。　　6.以酵母源Cu-MT为实验对象，初步评价了酵母源Cu-MT体外抗氧化活性;通过对酵母源Cu-MT的重金属脱除和再吸附能力的考察，评价了酵母源Cu-MT作为重金属解毒剂的可行性，结果为:Cu-MT对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH50％清除率量分别为0.03，0.04 mg和0.09 mg; Cu-MT在pH为6时，自身金属脱除率最高达到61.9％; MT对Cr6+、Pb2+、Cd2+和Cu2+吸附率分别为75.7％，62.1％，22.6％和12.4％。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 金属硫蛋白概述

1．1．1 金属硫蛋白

1．1．2 金属硫蛋白的基本特质

1．1．3 金属硫蛋白的结构特征

1．1．4 金属硫蛋白的生理功能

1．1．5 金属硫蛋白的检测方法

1．1．6 金属硫蛋白的分离纯化方法

1．1．7 金属硫蛋白的应用前景

1．2 金属硫蛋白与基因工程

1．2．1 金属硫蛋白的国外研究进展

1．2．2 金属硫蛋白的国内研究进展

1．3 课题研究的背景意义

1．4 本试验研究内容

1．4．1 MT工程菌的诱导培养

1．4．2 MT的分离与纯化

1．4．3 MT活性初步评价

第二章 MT工程菌的培育条件优化

2．1 材料与设备

2．1．1 实验菌株

2．1．2 菌株培养基

2．1．3 实验试剂

2．1．4 仪器设备

2．2 方法与步骤

2．2．1 菌种保藏方法

2．2．2 菌种的重金属耐受实验

2．2．3 菌种培育方法

2．2．4 菌种培育条件优化

2．2．5 诱导发酵方法

2．2．6 诱导发酵条件优化

2．2．7 MT测定方法

2．2．8 发酵罐培养

2．3 结果与分析

2．3．1 三种菌种的重金属耐受实验

2．3．2 菌种培育条件优化

2．3．3 诱导发酵条件优化

2．4 本章小结

第三章 发酵液中Cu-MT的分离与纯化

3．1 材料与设备

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 方法与步骤

3．2．1 发酵液预处理

3．2．2 平板膜超滤

3．2．3 MT浓缩液成分分析

3．2．4 MT的分离与纯化

3．3 结果与分析

3．3．1 发酵液预处理

3．3．2 平板膜超滤结果

3．3．3 浓缩液的成分分析

3．3．4 DEAE-FF对MT的静、动态吸附与解吸

3．3．5 DEAE-FF柱层析结果分析

3．4 本章小结

第四章 MT活性初步评价

4．1 材料与设备

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器设备

4．2 方法与步骤

4．2．2 Cu-MT对超氧阴离子自由基的清除率

4．2．4 不同pH条件下Cu-MT的Cu2+脱除

4．2．5 MT的重金属再吸附能力

4．2．6 原子吸收法测定金属含量

4．3 结果与分析

4．3．2 Cu-MT对超氧阴离子自由基的清除作用

4．3．3 Cu-MT对DPPH自由基的清除作用

4．3．4 Cu-MT的金属脱除率

4．3．5 MT的重金属再吸附能力

4．4 本章小结

结论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果