重组人乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其抑制剂筛选

摘要

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)作为一种存在于胆碱能突触间隙的由蛋白质分子构成的生物催化剂，属于生物神经传导中的一种关键性的酶。它不仅参与细胞的生长以及发育，同时对神经的再生和神经元的发育也有促进作用，并对维持人体神经系统的正常生理功能占有着非常重要的地位。乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)是AChE的水解底物，ACh会受AChE的催化发生裂解反应，导致ACh的缺失，从而使得各神经信号传递失败。而ACh水平的降低或活性的异常则是造成阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)发生的主要原因。近年来，通过提高ACh的水平来治疗AD，这已经成为目前主要的治疗方式。因此，通过抑制AChE来恢复或提高ACh的水平是治疗AD持续有效的方法。乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesteraseinhibitor, AChEI)能够选择性的抑制脑内AChE的活性，使ACh在大脑内的存留时间延长，提高AD病人的胆碱神经功能，同时也能有效缓解病人的认知能力障碍降低病人。　　迄今为止，对于轻、中度的AD治疗AChEI已经成为主流产品。经美国FDA批准上市的6种AChEI，它们分别是他克林(Tararine)、加兰他敏(Galanthamine)、利伐司替明(Rivastigmine)、石杉碱甲(HuperzineA)以及复方新药Namzari和多奈哌齐(Donepezil，E2020)，但是已经发现的AChEI还有较多缺点存在，例如半衰期短、毒性大以及较严重的胆碱能外周系统的副作用等，这使得它们在临床应用上面受到一定限制。因此，寻找发现作用时间长、副作用小的新一代AChEI仍是目前治疗AD药物的研究热点。　　本研究旨在利用体外人胚肾(HEK293)细胞建立表达重组人乙酰胆碱酯酶（Recombinant human acetylcholinesterase，rhAChE）的表达系统，使用pCMV-AChE质粒对其进行瞬时转染，分泌表达酶液到培养基，并通过对酶动力学的研究来考察重组表达蛋白的酶活性。使用DEAE-Sepharose FF亲和层析对高效表达的重组蛋白进行纯化，以获得纯度较高、活性较强的重组人乙酰胆碱酯酶，从而建立重组人乙酰胆碱酯酶抑制剂的体外评价筛选模型，并应用该模型从天然产物及其衍生物中筛选其中药抑制剂和对一系列化合物的抑制活性的测定。　　1、HEK293细胞分泌表达重组人乙酰胆碱酯酶(rhAChE)　　pCMV-AChE质粒由浙江大学药学院所赠送。测定pCMV-AChE的DNA序列确证AChE部分与AChE结构基因序列(GenBankAccessionNo:NM--000665)一致。通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pCMV-AChE从而对HEK293细胞进行瞬时转染。建立此表达系统分泌表达的rhAChE至细胞培养液中，收集细胞培养液作为酶液，进行AChE活性分析，最终获得粗酶液进行下一步纯化。　　2、rhAChE活性和检测体系研究　　采用改进的Ellman方法进行酶活检测:反应体系中加入酶液和显色剂DTNB(5，5'-二硫代双-2-二硝基苯甲酸)，pH为7.4的PBS，在37℃培养箱孵育6 min，加入底物碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)后37℃继续孵育16 min，最后加入SDS终止反应，使用酶标仪测定在412 nm下的吸光度(OD值)，rhAChE的反应速率单位用OD/min来表示。　　3、rhAChE的纯化和鉴定　　为获得纯度更高、活性更强的rhAChE，对收集的细胞培养液即酶液进行活性分析后，通过透析过夜，使用DEAE-Sepharose FF亲和层析柱梯度洗脱纯化，收集蛋白纯化液，进行活性检测，聚乙二醇4000进行5倍浓缩，BCA蛋白浓度试剂盒测得蛋白浓度为0.145 mg/mL，纯化液比活力为6.55 U/mg，纯化倍数为9.63，酶活回收率为56％。该酶的相对分子质量约为64 KD。以碘化硫代乙酰胆碱为底物时，酶的最适反应温度为37℃，最适pH为7.4，最适底物浓度为5 mmol/L。进行SDS-PAGE、Native-PAGE鉴定，在分子量64 KD附近出现明显的rhAChE的单一条带。纯化液进行Western blot分析，一抗为Anti-AChE antibody抗体，在分子量64 KD附近出现明显rhAChE单一条带。　　由于重组人乙酰胆碱酯酶的纯度会直接决定最终检测的准确性和可靠性，本实验对人的乙酰胆碱酯酶的分离纯化及生物学方面的意义做了研究，即如何使rhAChE的纯化效率达到最大，减少及简化纯化步骤，使酶活的损失降低，以提高纯化的倍数。　　4、rhAChE抑制剂的筛选　　多奈哌齐对AChE是可逆性的抑制剂，其在粗酶液的IC50为14.0 nmol/L。本研究选择7个浓度来测定多奈哌齐对纯化液rhAChE的抑制率效果，以化合物摩尔浓度的负对数和酶抑制率进行线性回归，求取IC50值。反应体系条件:pH7.4，酶量5μL，多奈哌齐浓度:0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160 nmol/L，底物浓度:0.5 mmol/L，反应温度37℃，反应时间16 min。结果测得纯化后的rhAChE的IC50明显降低为5.0 nmol/L左右。　　利用以上建立的人乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究模型进行rhAChE抑制活性评价和化合物的筛选，对评价后具有显著抑制活性的有效部位进行含量测定和结构鉴定。同时可以更高效、快捷的对来自天然药物中乙酰胆碱酯酶抑制剂成分作进一步筛选、鉴定。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 阿尔茨海默病

1．2 乙酰胆碱

1．2．1 乙酰胆碱的结构及性质

1．2．2 乙酰胆碱缺失的危害及防治

1．2．3 提高乙酰胆碱水平的方法

1．3 乙酰胆碱酯酶

1．3．1 乙酰胆碱酯酶结构特性

1．3．2 乙酰胆碱酯酶的研究进展

1．4 重组人乙酰胆碱酯酶(rhAChE)

1．4．1 HEK293细胞表达系统分泌表达rhAChE及意义

1．4．2 重组人乙酰胆碱酯酶的纯化研究

1．5 天然产物中重组人乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选

1．6 本研究的创新之处

1．7 主要研究内容

2 重组人乙酰胆碱酯酶的表达及表达条件优化

2．1 材料和试剂

2．1．1 主要仪器与设备

2．1．2 试剂与材料

2．2 试验方法

2．2．1 表达系统的构建及粗酶液的获得

2．2．2 酶活检测

2．2．3 rhAChE表达条件的优化

2．3 试验结果

2．3．1 rhAChE的表达系统建立

2．3．2 rhAChE粗提液表达条件的优化

2．4 讨论

3 重组人乙酰胆碱酯酶纯化

3．1 材料和试剂

3．1．1 仪器与设备

3．1．2 试剂与材料

3．2 试验方法

3．2．1 rhAChE的分离纯化

3．2．2 rhAChE的活性鉴定

3．2．3 BCA法检测蛋白质浓度

3．2．4 SDS-PAGE、Native-PAGE、Western blot分析鉴定重组蛋白

3．2．5 rhAChE性质的测定

3．3 试验结果

3．3．1 rhAChE表达液的纯化

3．3．2 SDS-PAGE、Native-PAGE、Western blot分析rhAChE纯化液

3．3．3 rhAChE纯化液理化性质

3．4 讨论

4 重组人乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选

4．1 重组人乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的建立

4．1．1 材料和试剂

4．1．2 试验方法

4．1．3 试验结果

4．2 讨论

5 结论与展望

参考文献

英文缩略词表

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致谢