极性基因KANADI1调控拟南芥营养生长阶段转变的机制研究

摘要

植物营养生长幼年向成年转变是植物发育的重要过程之一，是植物开花生殖生长的基础。该过程还参与调控植物生物量、株型、果实产量、抗逆性及次生代谢物合成等一系列重要的生理、生化过程。研究表明，植物幼年期向成年期阶段转变（即营养生长阶段转变）受保守的miR156-SPLs途径所调控。对于miR156-SPLs途径上下游因子调控网络解析已成为植物发育生物学研究的热点之一。　　KANADI1(KAN1)为植物远轴面极性基因，行使维持植物远轴面极性及抑制近轴面极性特征的功能。前人研究已经发行，KAN1基因功能缺失突变体(kan1-12)具有营养生长阶段转变提前表型，但是KAN1作为极性基因是如何来参与调控植物营养生长阶段转变的分子机制还不清楚。基于此问题，本研究以kan1-12为研究对象，通过突变体营养生长阶段转变相关表型考察、miR156-SPLs途径基因表达检测、并利用GUS染色分析、双突变体遗传关系分析、基因异位表达分析及ChIP分析，对KAN1调控拟南芥营养生长阶段转变的分子机制进行研究，主要工作及结果如下:　　1.kan1-12下表皮毛提前发生，早花，表现为营养生长及生殖阶段转变提前;　　2.qRT-PCR基因表达检测发现kan1-12中SPL9及其下游miR172表达量上调;　　3.构建了pKAN1∷GUS转基因报告株系，GUS染色分析显示KAN1具有远轴面极性表达模式;而对pSPL9∷rSPL9-GUS转基因材料GUS染色分析显示，SPL9具有近轴面极性表达模式。KAN1功能缺失会引起SPL9表达上调并在叶片的远轴面异位表达;　　4.遗传分析显示，miR156过表达和SPL9功能缺失突变体可部分回复kan1-12突变表型，结合基因检测结果，表明SPL9作用于KAN1下游;　　5.构建了SPL9∷KAN1、pKAN1∷rSPL9及pKAN1∷miR156异位表达转基因材料。表型考察显示pSPL9∷KAN1营养生长阶段转变延迟，pKAN1∷rSPL9营养生长阶段转变提前，pKAN1∷miR156营养生长阶段转变延迟，表明KAN1在远轴面抑制SPL9的表达对于维持植物正常的营养生长阶段转变是必须的;　　6.为了验证KAN1是否直接调控SPL9，构建了pKAN1∷3×Flag-KAN1/kan1-12转基因回复材料，表型考察显示pKAN1∷3×Flag-KAN1可回复kan1-12表型，说明3×Flag-KAN1融合蛋白具有相应的KAN1的生物学活性及功能;基于此株系，我们利用FLAG抗体开展了染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析，结果表明KAN1可直接结合至SPL9基因启动子区域-469bp处的保守结合位点。　　本研究发现植物远轴极性基因KAN1可在叶片远轴面直接结合到SPL9启动子调控区域抑制其表达，从而来精确调控植物营养生长阶段转变。基于上述研究结果，我们提出了如下基于KAN1-SPL9的调控拟南芥植物营养生长阶段转变的模型:拟南芥营养生长发育早期（即幼年期），SPL9表达受到KAN1及miR156双重抑制，即1、KAN1直接结合SPL9启动子来抑制SPL9转录;2、miR156对SPL9转录后水平进行负调控，此时低水平表达的SPL9被限制于叶片近轴面;随着植物发育，miR156水平逐渐下调，SPL9转录后负调控被逐步解除，SPL9表达量升高并扩展至叶片远轴面，使得叶片远轴面发生下表皮毛，植物顺利进入幼年向成年转变过程。本研究揭示了植物极性基因网络与营养生长阶段转变调控基因网络间存在直接调控关系，丰富了植物保守miR156-SPLs途径的上游基因调控网络，为今后研究植物叶片发育与发育时序性(Development timing)提供了基础，并且研究成果有望将来为基于miR156-SPLs基因途径及极性基因网络途径调控植物生物量、株型、抗逆性、次生代谢产物等提供参考。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 植物营养生长阶段转变研究进展

1．1．1 植物营养生长阶段转变的特征

1．1．2 植物营养生长阶段转变的基因调控网络

1．2 植物近-远轴极性建成研究进展

1．2．1 植物叶片近-远轴极性起源及形态特征

1．2．2 叶片近．远轴极性建成的基因调控网络

1．3 极性基因与营养阶段转变关系

1．4 研究目的与意义

第二章kanl-12表型考察、基因表达检测及遗传关系分析

2．1 实验材料

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂及溶液配方

2．2 实验方法

2．2．1 拟南芥种植与表型考察

2．2．2 拟南芥RNA提取及cDNA制备、qRT-PCR检测

2．2．3 转基因材料的创制

2．2．4 GUS染色

2．2．5 拟南芥双突构建及纯合筛选

2．3 结果与分析

2．3．1 kan1-12表型考察

2．3．2 kan1-12中miR156-SPLs途径相关基因表达检测

2．3．3 KAN1与SPL基因空间表达模式分析

2．3．4kan1-12与miR156-SPLs途径相关突变体遗传关系分析

第三章 KAN1与SPL9作用关系研究

3．1 实验材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 主要试剂及溶液配方

3．2 实验方法

3．2．1 转基因材料的创制

3．2．2 染色质免疫沉淀实验

3．3 结果与分析

3．3．1 SPL9、KAN1、miR156异位表达分析

3．3．2 pKANI∷3×FALG-KAN1回复kan1-12结果

3．3．3 ChIP分析

第四章 结果

第五章 讨论

参考文献

附表

致谢

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