布鲁氏菌的分型鉴定及其SOD蛋白的原核表达和多抗制备

摘要

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患的全身性传染病。布鲁氏菌的宿主范围主要包括家畜、野生动物和人等,该病的临床症状为长期发热、多汗、流产与不育、关节痛及肝脾肿大等。布鲁氏菌病的广泛流行,给世界各国的养殖业带来了巨大的经济损失,同时该病也给广大一线兽医和养殖者的健康带来了严重的威胁,因此了解该病的致病机制,做好该病的预防和监测工作是事关重要的。　　本实验通过PCR(polymerase chain reaction)分子生物学检测方法对16SrDNA、omp2b基因、Cu/Zn-SOD基因、omp28基因、omp10基因、omp25基因、virB10基因等的应用来对病料进行分离鉴定,又通过布鲁氏菌的分型方法AMOS–PCR对其进行分型。结果表明通过PCR方法检测的53份病料中,有50份检测结果为阴性,3份为阳性,检出率为5.66％,且经分型后发现2份为牛种布鲁氏菌,1份为羊种布鲁氏菌;而通过细菌分离培养的方法只分离到2份为阳性,检出率为3.77%;PCR方法比细菌分离方法的检出率高出1.89个百分点,细菌分离法和PCR检测方法的阳性符合率为100%。　　为分析布鲁氏菌相关蛋白的免疫原性,本实验又以B.abortus疫苗株104M为模板,通过PCR方法扩增Cu/Zn-SOD基因和omp28基因,并将其克隆至pGEX-4T-1(+)和pET32a载体进行蛋白的重组表达和纯化。　　经一系列活性检测后发现,重组的pGEX-SOD蛋白与牛源布鲁氏菌阳性血清具有良好的反应性。以重组pGEX-SOD蛋白为包被抗原进行间接ELISA检测发现其能区分布鲁氏菌的阴性和阳性血清。将重组pGEX-SOD蛋白免疫BABL/C小鼠制备多克隆抗体,纯化制备出不含杂质的多抗。构建真核表达载体PCI-neo-SOD,提取超纯质粒转染293T细胞,IFA检测所制备多抗与转染后的细胞具有一定的反应性。　　实验表明布鲁氏菌的Cu/Zn-SOD等基因可以作为布鲁氏菌病的检测基因使用,而且重组的布鲁氏菌Cu/Zn-SOD蛋白具有良好的免疫原性,表明利用布鲁氏菌的Cu/Zn-SOD等基因和其所编码的蛋白以及制备的抗体建立布鲁氏菌病原学检测诊断方法具有很重要的意义。

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第一部分 文献综述

1.布鲁氏菌简介

2.布鲁氏菌的发现及其分类

3.布鲁氏菌病流行病学

4.布鲁氏菌病病原学

5.布鲁氏菌病检测诊断方法

6.研究目的和意义

第二部分 研究内容第一章 布鲁氏菌的分型鉴定

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二章 布鲁氏菌相关蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

1材料

2 方法

3.结果

4.讨论

第三章 多克隆抗体的制备

1 材 料

2 方 法

3.结果

4.讨论

5.全文总结

附录 常用缓冲液及培养基配方

附录 缩 略 词

参考文献

个人简介

致谢