两种蟾蜍(Bufo)MCL-1 cDNA的克隆及其重组蛋白表达与抗血清的制备

摘要

髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)是bcl-2家族的一个抗凋亡成员,在凋亡调控中具有重要作用。由于mcl-1可以直接调控细胞分化和细胞周期,所以与肿瘤的发生发展密切相关。以蟾蜍为基源的中药材蟾酥常被用于包括肿瘤在内的多种疾病的治疗。本研究首先通过对日本蟾蜍皮肤质粒文库筛选获得了mcl-1基因,对该基因进行生物信息学分析及预测,并与其它物种进行同源性比对及分析。在日本蟾蜍mcl-1 cDNA序列基础上,设计特异性引物,从中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA中克隆mcl-1 cDNA和开放阅读框(ORF)。对两种蟾蜍的ORF进行原核表达载体的构建、重组蛋白表达纯化及小鼠抗血清的制备,为研究其生物学功能和药物研发奠定基础。　　通过试验得出以下结论:　　1、对日本蟾蜍皮肤 cDNA质粒文库盲筛获得 mcl-1 cDNA(GenBank登录号为JX219482),全长为1090 bp,ORF由639个碱基组成,编码由212个氨基酸残基组成的蛋白质。经氨基酸序列同源性比对发现,该基因编码蛋白具有与人类MCL-1相似的保守基序、功能结构域、跨膜结构域及多个磷酸化位点,有继续研究的价值。　　2、成功克隆13个中华大蟾蜍皮肤mcl-1 cDNA序列,为该基因的序列分析提供数据。　　3、成功构建两种蟾蜍的原核表达载体pET-28b-mcl-1并确认其重组蛋白在E. coli BL21(DE3)中表达,为后续 MCL-1重组蛋白的大量表达、纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定基础。　　4、成功制备两种蟾蜍MCL-1的小鼠抗血清,为检测该蛋白在蟾蜍组织中的表达以及研发MCL-1相关抗癌药物提供理论依据。

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前言

第一章 文献综述

1.1 BCL-2 家族蛋白特征及组成

1.2 MCL-1的生物学特性及功能

1.3 MCL-1的表达调控

1.4 MCL-1与人类疾病

1.5 MCL-1与肿瘤的治疗

第二章 日本蟾蜍MCL-1 cDNA的克隆及生物信息学分析

2.1 实验材料和试剂

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 中华大蟾蜍MCL-1 cDNA及ORF的克隆及分析

3.1 材料与方法

3.2结果

3.3 讨论

第四章 MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

4.1 材料与方法

4.2结果

4.3 讨论

第五章 MCL-1抗血清的制备及效价检测

5.1 材料及溶液配制

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

作者简介

致谢