朵丽蝶兰成花相关基因DhEFL4基因和启动子的分离与功能验证

摘要

朵丽蝶兰(Doritaenopsis)由蝴蝶兰(Phalaenopsis)与朵丽兰(Doritis)杂交而成属于广义上的蝴蝶兰,由于其花色艳丽,花期持久,因而深受消费者欢迎,市场占有率高,具有较高的观赏价值和经济价值。　　本研究通过在Hong-Hwa Chen建立的OrchidBase的cDNA文库中的EST序列进行比对分析,筛选出两个与玉米(Zea mays)中EFL4同源性很高的序列,以出瓶7个月左右的朵丽蝶兰‘Tinny Tender’(Doritaenopsis Happy smile×Happy valentine)克隆苗为试材,利用RACE技术分离基因的cDNA序列,并通过转基因进行功能验证。同时利用染色体步移技术获得DhEFL4启动子序列。取得的主要研究结果如下:　　1、利用RACE的方法克隆到了朵丽蝶兰中DhEFL4基因的cDNA序列,其中,获得了DhEFL4基因的cDNA序列593bp bp,含有一个345 bp的ORF区,编码114个氨基酸。　　2、通过由处于光照进入黑暗时分朵丽蝶兰的根、茎、叶、花梗、花蕾及花器官(花瓣、萼片、唇瓣和蕊柱)进行实时定量PCR,发现花蕾的表达量最高,说明DhEFL4和朵丽蝶兰成花相关。同时分别采集短日照和长日照处理条件下朵丽蝶兰的叶片(一昼夜中每隔两小时采集一次),将长日照和短日照的叶片分别进行实时定量PCR,建立了DhEFL4基因的昼夜节律,结果显示DhEFL4基因具备明显又规律的昼夜节律性,而且长、短日照下的表达规律不同,说明日照时间还是会影响到朵丽蝶兰的成花,即使朵丽蝶兰是光钝感植物。　　3、以pCAMBIA1301为植物表达载体,pMD20-T为中间载体,构建了PC1301-DhEFL4正义表达载体。　　4、采用蘸花法侵染拟南芥,利用潮霉素筛选纯合子并观察其表型变化,结果表明,DhEFL4转基因植株的开花时间有很明显的延迟,并且抽葶数增加,在DNA和RNA水平上均能检测到相应基因在转基因植株体内的表达,这一结果与拟南芥中的报道基本一致,可推测DhEFL4基因也是通过光周期途径调控朵丽蝶兰成花。　　5、获得DhEFL4 ATG前2604bp序列,经过PLACE、Plant care启动子专业软件的分析,发现序列中包含了TATA、CAAT、Circadian等一系列元件。

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第一章 文献综述

1.1高等植物成花转变研究进展

1.2光周期途径

1.3蝴蝶兰成花研究进展

1.4研究的目的和意义

第二章 朵丽蝶兰DhEFL4基因部分序列的获得与分析

第三章 DhEFL4基因的克隆

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章 DhEFL4启动子的克隆与分析

4.1 材料与方法

4.3结果与分析

4.4 讨论

第五章 DhELF4基因的时空表达

5.1试验材料

5.2试验方法

5.3结果与分析

5.4讨论

第六章 DhEFL4基因表达载体的构建

6.1试验材料

6.2试验方法

6.2.13连接产物转化大肠杆菌及阳性克隆筛选

6.3结果与分析

5.4讨论

第七章 农杆菌介导法转化拟南芥

7.1试验材料

7.2试验方法

7.3结果与分析

7.4讨论

第八章 结论与展望

8.1研究结论

8.2研究展望

参考文献

致谢