枇杷磷酸果糖激酶基因的分离及表达分析

摘要

枇杷果实由于果肉柔软多汁，酸甜适度，味道鲜美，深受人们的喜爱，但我国多数枇杷品种果实含糖量低，风味偏淡，这在一定程度上制约了枇杷的发展。磷酸果糖激酶是糖酵解过程中最重要的调节酶之一，调节糖酸之间的平衡，糖酵解速度主要决定于该酶活性，它是一个限速酶，对糖酵解起关键作用，因此研究磷酸果糖激酶基因的功能及对枇杷糖代谢的分子调控机理，对提高果实品质具有重要意义。　　 本研究以浙江农林大学成年枇杷树为材料，克隆磷酸果糖激酶基因，分析其在果实发育过程中的表达水平，探索其在枇杷果实糖代谢中的分子调控机制，研究结果如下：⑴采用RACE技术从枇杷中分离得到磷酸果糖激酶基因的全长cDNA序列，该基因长度为1876bp，其中含有一个1710bp完整开放阅读框，共编码569个氨基酸，5'UTR区88bp，3'UTR区78bp，含有一个poly(A)尾，对该序列进行分析，分析显示枇杷磷酸果糖激酶基因编码蛋白与其他植物磷酸果糖激酶蛋白的相似性达70％-90％以上。聚类分析表明，枇杷EjPFPb基因编码蛋白与蓖麻、杨树等植物的EjPFPb蛋白遗传距离较近，与烟草等距离较远。⑵利用荧光核酸原位杂交技术明确基因亚细胞分布及表达丰度，探索其在细胞中的作用机制，结果表明转入了载体的融合蛋白在细胞膜中是可见的。利用Real-TimeRT-PCR技术分析果实发育进程中磷酸果糖激酶基因动态表达，结果显示枇杷两个品种在果实发育的不同阶段，EjPFPb基因表达水平不同。⑶利用烟草遗传转化体系对磷酸果糖激酶基因功能进行分析，建立了一套高效的烟草遗传转化体系，探索磷酸果糖激酶基因在枇杷果实糖代谢中的分子调控机制，为探索枇杷果实品质形成机理提供理论依据。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 我国枇杷资源概况

1．2 果实糖代谢

1．2．1 转化酶与糖代谢

1．2．2 蔗糖合成酶与糖代谢

1．2．3 蔗糖磷酸合成酶与糖代谢

1．3 枇杷果实中的糖分组成及糖积累

1．3．1 不同枇杷品种糖分的组成

1．3．2 枇杷果实糖的积累动态

1．3．3 枇杷果实糖代谢酶的动态变化

1．4 枇杷果实糖代谢分子生物学

1．5 枇杷中酸的的组成及代谢酶

1．6 栽培管理措施对枇杷果实糖酸组成的影响

1．7 磷酸果糖激酶

1．7．1 磷酸果糖激酶的简介

1．7．2 磷酸果糖激酶基因结构及功能

1．7．3 磷酸果糖激酶在果实糖代谢中的作用

1．7．4 磷酸果糖激酶活性调节

1．7．5 磷酸果糖激酶分子生物学研究进展

1．8 展望

1．9 本论文研究的目的及意义

2 枇杷磷酸果糖激酶基因的分离

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 酶及生化试剂

2．2 实验方法

2．2．1 总RNA提取及检测

2．2．2 反转录反应

2．2．3 反转录产物PCR

2．2．4 目的基因片段的回收

2．2．5 基因克隆及测序

2．2．6 3’RACE

2．2．7 5’RACE

2．3 结果与分析

2．3．1 枇杷不同组织RNA质量检测

2．3．2 枇杷磷酸果糖激酶基因分离

2．3．3 枇杷磷酸果糖激酶基因编码蛋白质分析

3 磷酸果糖激酶亚细胞定位

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 表达载体的构建

3．2．2 洋葱表皮细胞培养

3．2．3 基因枪轰击洋葱表皮细胞

3．2．4 利用激光共聚集显微镜进行亚细胞定位

3．3 结果与分析

4 磷酸果糖激酶基因表达模式分析

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 RNA的提取

4．2．2 反转录反应

4．2．3 Real-Time RT-PCR反应体系及程序

4．2．4 数据处理

4．3 结果与分析

5 磷酸果糖激酶基因转化烟草的研究

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 菌株、植物转化载体

5．1．3 仪器设备

5．1．4 培养基与试剂

5．2 实验方法

5．2．1 农杆菌感受态细胞的制备

5．2．2 冻融法转化农杆菌

5．2．3 烟草种子萌发获得无菌苗

5．2．4 烟草组培再生体系的建立

5．2．5 农杆菌介导转化烟草

5．3 结果与分析

5．3．1 烟草再生体系的建立

5．3．2 卡那霉素敏感性的测定

5．3．3 影响烟草转化的条件

6 小结与讨论

7 结论

参考文献

附录一：表格

附录二：图

个人简介

致谢