鸭疫里氏杆菌的分子诊断及抗药性研究

摘要

鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎的病原菌，主要侵染2～8周龄雏鸭，对养鸭业危害十分严重。RA有21个血清型，各血清型之间缺乏交叉保护能力。目前，对RA的防控主要依靠抗生素，但RA对抗生素易产生耐药性，临床防治效果不佳。对RA的诊断主要依靠血清学诊断，费时费力。鉴于此，本论文建立了用分子生物学技术快速确诊RA的方法，并采用纸片扩散法检测RA对抗菌药物的敏感性，旨在为快速诊断和临床防治RA病提供科学依据。　　 经对浙江省临安市横畈麻鸭养殖场发病雏鸭致病菌进行分离培养、生理生化鉴定，获得14株符合RA生物学特性的分离株。基于RA的16S rRNA基因保守序列设计引物，建立PCR法对RA进行诊断。结果6株标准株RA、14株临床分离疑似RA能扩增出698 bp的特异性条带，而鸭大肠杆菌(Escherichia coli)和鸭沙门氏菌(Salmonella)未能扩增出特异性条带。测序结果分析显示，与NCBI上RA菌株相应片段相似性达99.9％。利用这对引物以RA不同稀释度菌液为模板进行PCR敏感度检测，最小检出量为2.3×103 CFU/mL。　　 用该法对鸭场随机送检的10只病死鸭组织（肝脏、脑、心血、脾、肠、肌肉）的诊断研究发现:脑组织中RA检出率最高，其次为心血、肝脏和脾，肠和肌肉未检出。PCR法的检出率为90％，细菌分离鉴定检出率为70％， PCR法检出率比细菌分离鉴定检出率高20％。研究结果表明:基于16S rRNA基因序列的PCR检测方法在RA诊断中具有特异、灵敏和快速的优点。　　 使用9种常用抗生素和中药黄连汤（由黄连、黄柏、甘草组成的复方汤剂），以纸片扩散法对RA进行抑菌试验，发现RA对黄连汤、诺氟沙星和氯霉素高度敏感，其敏感度相对应的为100％、95％和90％;对头孢拉定、新霉素和四环素中度敏感，中度敏感率分别为90％、85％和80％;对卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氨苄西林耐药性很强，其耐药率相应为100％、85％、80％和65％。建议临床防治RA病时，宜首先采用中药，不仅防治效果良好，还能减少细菌耐药性发生，降低抗生素使用量，提高鸭产品品质。

目录

声明

摘要

第一章 鸭疫里氏杆菌的研究进展

1．1 鸭疫里氏杆菌病原学研究进展

1．1．1 鸭疫里氏杆菌的命名和分类

1．1．2 鸭疫里氏杆菌的生物学特性

1．1．3 鸭疫里氏杆菌的血清型

1．1．4 鸭疫里氏杆菌的毒力相关因子

1．1．5 流行病学研究进展

1．1．6 临床症状与病理变化研究进展

1．3 鸭疫里氏杆菌的检测与诊断方法研究进展

1．3．1 临床诊断

1．3．2 实验室诊断

1．4 鸭疫里氏杆菌病的防治研究进展

1．4．1 药物防治的研究进展

1．4．2 疫苗防治的研究进展

1．5 鸭疫里氏杆菌外膜蛋白研究进展

1．5．1 细菌外膜蛋白的简介

1．5．2 外膜蛋白的结构及功能研究进展

1．5．3 鸭疫里氏杆菌外膜蛋白的毒力研究进展

1．5．4 鸭疫里氏杆菌外膜蛋白的免疫原性研究进展

1．6 本研究的目的及意义

第二章 鸭疫里氏杆菌的分离及鉴定

2．1 材料

2．1．1 病料来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 细菌的分离培养

2．2．2 分离株的理化鉴定

2．2．3 分离株的血清型鉴定

2．3 结果

2．2．1 细菌的分离培养结果

2．2．2 细菌理化鉴定结果

2．2．3 血清型鉴定结果

2．4 讨论

第三章 鸭疫里氏杆菌的PCR诊断

3．1 材料

3．1．1 菌株

3．1．2 实验动物

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 细菌的培养

3．2．2 引物的设计与合成

3．2．3 细菌DNA的提取

3．2．4 PCR反应体系及产物的测序

3．2．5 PCR特异性检测

3．2．6 PCR敏感性检测

3．2．7 RA分离株的PCR鉴定

3．2．8 临床病料的诊断

3．2．9 动物回归试验

3．3 结果

3．3．1 RA的PCR扩增及测序结果

3．3．2 PCR特异性检测结果

3．3．3 PCR敏感性检测结果

3．3．4 RA分离株检测结果

3．3．5 RA菌种的保存

3．3．6 临床病料诊断结果

3．3．7 动物回归试验结果

3．4 讨论

第四章 鸭疫里氏杆菌分离株的抗药性试验

4．1 材料

4．1．1 菌株

4．1．2 主要试剂及药敏纸片

4．2 方法

4．2．1 黄连汤的制备

4．2．2 中药黄连汤药敏片的制备

4．2．3 药敏试验

4．3 结果

4．4 讨论

全文结论

参考文献

附录

附录一：缩写词英汉对照

附录二：序列比对结果

作者简介

致谢