具有杀松材线虫活性的苏云金芽孢杆菌cry基因的克隆

摘要

化学农药在防治农业有害生物方面的应用效果显著,但是由于化学农药的过量使用,环境问题也随之产生。生物农药以其独显的高效低毒的特点,将在农业病虫害防治中得到越来越广泛的应用。苏云金芽孢杆菌制剂是目前研究最为深入,应用最为广泛的生物农药。其产物的结晶伴胞晶体蛋白对磷翅目、半翅目昆虫具有特异的毒杀效果。挖掘我国丰富的Bt资源,筛选出更多具有杀虫活性的Bt菌,分离克隆其编码杀虫蛋白的基因,对构建Bt工程菌,培育转Bt的抗虫植物具有深远的意义。　　 松材线虫是一种林业有害生物,对松树具有毁灭性的危害,它通过松墨天牛进行传播,松树一旦感染上松材线虫,将在很短的时间内死亡。目前,对松材线虫的防治主要是针对其媒介昆虫松墨天牛来进行的,主要以化学防治为主,直接针对松材线虫进行防治难度较大,国内外研究的较少。本实验室从环境中分离出80株苏云金芽孢杆菌,初步筛选出8株对松材线虫具有毒杀作用的菌株,进一步提取这8株菌株的伴孢晶体蛋白,对松材线虫进行毒力测定,最后筛选出一株对松材线虫具有最强毒杀活性的菌株,命名为ZJFC85菌株。　　 已经知道对松材线虫具有毒杀活性的是ZJFC85菌株编码产生的伴孢晶体蛋白,为了能为培育出抗松材线虫病的松树树种提供遗产材料,本实验室将克隆出ZJFC85菌株中能编码产生的伴孢晶体蛋白cry基因。通过查阅文献,设计9对cry基因保守区域的引物,以ZJFC85菌株质粒DNA为模板进行PCR扩展,扩增出一段保守区域序列cryl,对cryl基因进行克隆,克隆产物送出测序,测序结果分析该菌株含有crylAa基因,设计crylAa基因的特异性引物,PCR扩增得到crylAa基因的全长基因,对cryl基因的全长基因进行克隆,得到我们需要的遗产材料。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 松材线虫病危害及其防治研究

1．1．1 松材线虫病危害

1．1．2 松材线虫病防治研究

1．2 苏云金芽孢杆菌研究进展

1．2．1 苏云金芽孢杆菌简介

1．2．2 苏云金芽孢杆菌的生物学特性

1．2．3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类及杀虫谱

1．2．4 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的生物活性

1．2．5 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的克隆

1．2．6 苏云金芽孢杆菌在杀线虫防治上的研究。

1．3 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株和质粒

2．1．2 培养基与试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 Bt菌株的培养和保存

2．2．2 Bt菌总DNA的提取

2．2．3 Bt质粒DNA的提取

2．2．4 琼脂糖凝胶电泳

2．2．5 Bt cry基因的克隆

3 结果与分析

3．1 苏云金芽孢杆菌质粒DNA提取电泳图谱

3．2 Bt菌株zjfc85中的cry基因的克隆及序列测定

3．2．1 Bt菌株zjfc85中的cry基因的克隆

3．2．2 Bt菌株zjfc85中的cry基因部分序列测定及分析

3．3 Bt菌株zjrc85中的cry1Aa全长基因的克隆

3．3．1 Bt菌株Zjfc85中的cry1Aa全长基因的克隆

3．3．2 Bt菌株zjfc85中的cry1Aa全长基因的测序及分析

4 讨论

4．1 苏云金芽孢杆菌质粒DNA的提取

4．2 苏云金芽孢杆菌cry1Aa全长基因的扩展

4．3 苏云金芽孢杆菌cry1Aa全长基因的克隆

4．4 利用苏云金芽孢杆菌防治松材线虫病的探索

4．5 进一步展望和接下来的工作

参考文献

附录

作者简介

致谢