RASSF1A基因在食管磷癌中的转录表达及其启动子区5’-CpG岛甲基化状态的研究

摘要

染色体3p21区域遗传不稳定性是肺癌、鼻咽癌、食管癌等多种恶性肿瘤中高发和早期的细胞遗传学变异，提示该区域存在一个乃至多个与肿瘤发生密切相关的基因。这些基因的表达异常及变异的不断积累可导致细胞突变频率增加和基因组不稳定，最终引起细胞恶变，导致肿瘤形成。近年来研究发现，染色体3p21区域的遗传不稳定性与食管癌的发生、发展密切相关。　　Ras相关区域家族1A(RAS association domain family1A，RASSF1A)基因是2000年从3号染色体短臂，即3p21.3区域克隆出来的新型候选抑癌基因，其表达失活已在人类多种组织来源的良、恶性肿瘤中被发现，包括肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和头颈部肿瘤等。现已明确部分RASSF1A基因失活的主要机制之一，是由于其启动子区5’-CpG岛的异常高甲基化所致。RASSF1A基因高甲基化能通过DNA自身化学修饰方式而抑制RASSF1A基因的转录使其表达缺失、丧失负性调控细胞周期的功能，使细胞易于发生恶性转化，从而促进肿瘤的发生与发展。　　业已证实，RASSF1A基因具有调控细胞周期、抑制有丝分裂、诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖等功能，在多种肿瘤中由于启动子区高甲基化而失活。为系统研究RASSF1A基因在食管磷癌中的作用，本课题选择RASSF1A基因作为研究目标，分析了散发性食管鳞癌中 RASSFlA基因的转录表达水平及其启动子区域5’-CpG岛甲基化状况，探讨RASSFlA基因在食管鳞癌发生、发展中的意义。　　本研究由四大部分组成：　　1、RASSFlA基因在人食管鳞癌细胞株中转录表达及启动子区域5’-CpG岛甲基化状态的研究　　目的：探讨启动子区域5’-CpG岛甲基化对人食管鳞癌细胞株细胞RASSFlA基因转录表达的作用，及去甲基化制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-Aza-cdR）干预对启动子区域5’-CpG岛甲基化的影响，为临床治疗食管鳞癌奠定理论基础。　　方法：将6个人食管鳞癌细胞株（KYSE180、KYSE410、KYSE1170、EC1、EC18和 EC109）分别按照5×105细胞数接种到培养瓶中培养24 h细胞贴壁后分为两组（加药组和不加药组），其中加药组在6种细胞株中分别加入含有1 umol/L的5-Aza-CdR的培养基，不加药组在正常的完全培养基中继续培养，分别培养72h后收集细胞，应用实时荧光定量甲基化PCR(real-time methylation-specific PCR，qMSP)检测加药组和不加药组RASSFlA基因启动子区域5’- CpG岛甲基化状态，应用实时逆转录聚合酶链反应qRT-PCR（Real time RT-PCR）检测两组的RASSFlA mRNA表达情况。　　结果：6个人食管鳞癌细胞株的检测结果如下，不加药组：RASSF1A基因在EC1中高甲基化、在EC18和KYSE410中部分甲基化，在KYSE180、KYSE1170和EC109中无甲基化；qRT-PCR分析RASSFlA基因转录表达的结果表明，在EC1中表达缺失，在EC18和KYSE410中有低水平表达，在KYSE180、KYSE1170和EC109中正常表达。加药组：6个人食管鳞癌细胞株均表现为非甲基化状态；EC1、EC18和KYSE410的RASSFlA mRNA均恢复到正常表达水平，而KYSE180、KYSE1170和EC109的表达水平无明显变化。　　结论：RASSFlA基因启动子区域5’-CpG岛甲基化是导致其在EC1中转录全失活、EC18和KYSE410中部分转录失活的主要原因，5-Aza-cdR可以逆转人食管鳞癌细胞株EC1、EC18和KYSE410中RASSFlA基因启动子区域5’-CpG岛甲基化状态，使其重新表达，提示临床基于表观重塑治疗食管鳞癌的可行性。　　2．RASSFlA基因在原发性食管鳞癌中转录表达的研究　　目的：分析散发性食管鳞癌中RASSFlA基因的转录表达水平，探讨RASSFlA基因在食管鳞癌发生发展中的意义。　　方法：应用Real time RT-PCR技术检测49例食管鳞癌患者癌组织及癌旁正常组织中RASSF1A基因的转录表达水平，并分析其与临床病理等参数及预后之间的关系。　　结果：在49例食管鳞癌标本中，有26（53.06％）例出现了下调，5（10.20%）例表达上调，18（69.23%）例正常表达。RASSFlA mRNA在食管鳞癌组织及相应的癌旁正常组织中的表达水平存在显著统计学差异(P<0.05)。RASSFlA mRNA的表达缺失与食管鳞癌的淋巴结转移、TNM分期及不良预后分别存在显著相关性(P<0.05)。　　结论：RASSF1A基因的转录表达缺失与食管鳞癌的发生发展密切相关，可能是食管鳞癌的发生发展因素之一。　　3.食管鳞癌组织中RASSFIA基因启动子区域5’-CpG岛甲基化状态的研究　　目的：分析散发性食管鳞癌中RASSFIA基因启动子区域5’-CpG岛甲基化状态，并探讨其在食管鳞癌发生发展中的意义。　　方法：运用qMSP分别检测49例食管鳞癌患者癌组织及癌旁正常组织中RASSF1A基因启动子区域5’-CpG岛的甲基化状态，并分析其与临床病理等参数及预后之间的关系。　　结果：在49例原发食管鳞癌组织中，RASSFlA基因启动子区域5’-CpG岛甲基化的有38(77.6.0%)例，未发生甲基化的有11(22.4%)例；与之相对应的癌旁正常组织中部分甲基化的有3（6.1%）例，其余46（93.9%）例均未发生甲基化，两者差异有统计学意义（P<0.05）。RASSFlA基因高甲基化与临床分期、淋巴结转移及不良预后分别存在显著相关性（P<0.05）。　　结论：RASSFlA基因启动子区域5’-CpG岛的高甲基化是食管鳞癌频发的分子事件，食管鳞癌组织中RASSFlA基因启动子区域5’- CpG岛的高甲基化明显高于癌旁正常组织，并且与临床分期，淋巴结转移及不良预后显著相关，提示该基因的高甲基化在食管鳞癌的病变过程中有着重要的作用，是一个潜在的预后相关因子。　　4. RASSFlA基因在食管鳞癌中转录表达缺失的机制研究　　目的：探讨RASSFlA基因在食管鳞癌中转录表达缺失的原因。　　方法：结合第二、三部分实验结果，分析RASSFlA基因在食管鳞癌中转录表达情况与其启动子区域5’-CpG岛甲基化状态之间的关系。　　结果：在26例RASSFlA基因转录表达缺失的食管鳞癌组织中有24例发生了启动子区域5’-CpG岛的高甲基化，另外2例则发生了半甲基化。而在23例没有RASSFlA基因转录表达缺失的食管鳞癌组织中未发现有启动子区域5’-CpG岛高甲基化的情况，其中12例发生了半甲基化，11例为非甲基化状态。RASSFlA基因在食管鳞癌中的转录表达缺失与其启动子5’-CpG岛高甲基化显著相关（P<0.05）。　　结论：RASSFlA基因启动子区域5’-CpG岛异常甲基化是导致其转录表达缺失的主要原因之一。

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中文摘要

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前言

第一部分RASSFlA基因在人ESCC细胞株中转录表达及启动子区域5’-CpG岛甲基化状态的研究

材料与方法

一．实验材料

二、实 验 方 法

结果

分析与讨论

小结

第二部分RASSFlA基因在原发性ESCC中转录表达的研究

材料与方法

一．实验材料

二、 实验方法

三．统计学分析

结果

一、总RNA的质量鉴定

二．ESCC组织及对应癌旁正常食管上皮组织中RASSFlA基因转录表达情况

分析与讨论

小结

第三部分 ESCC组织RASSFIA基因启动子区域5’-CpG岛甲基化状态的研究

材料与方法

一、实验材料

二、 实验方法

三、统计学分析

结果

一、RASSFlA基因启动子甲基化在ESCC组织及癌旁正常组织中的发生情况

二．ESCC组织中RASSFIA基因启动子甲基化与临床病理特征的关系(表5)

三、 RASSFlA的甲基化状态与ESCC预后之间的关系

分析与讨论

小结

第四部分RASSFlA基因在ESCC中转录表达缺失的机制研究

材料与方法

结果

分析与讨论

小结

结论

参考文献

致谢

文献综述:食管鳞癌染色体3p21区域遗传不稳定性的研究进展