桑叶1-脱氧野尻霉素降糖降脂机理及其产生菌的筛选

摘要

桑叶是药食同源的资源之一，具有降血糖、降血脂等多种功效。1-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种生物碱，主要来源于桑树。DNJ已经被证明具有降血糖、降血脂、延缓衰老等多种功能，这些功能中尤其以降血糖降血脂最引人关注，但其作用机理还不是很清楚。本论文以Ⅱ型糖尿病db/db小鼠为模型，调查了DNJ处理后血糖、胰岛素、血脂等生化指标的变化，利用组学手段，从转录和代谢两个层面探索DNJ降糖降脂的机理;并从桑叶根际土壤筛选并鉴定出产DNJ菌株。本论文的研究，明确了桑叶DNJ调控血糖和血脂的机理，为把桑叶开发成功能食品提供了理论依据和指导，同时为拓展DNJ的新来源建立了基础。
　　桑叶DNJ对db/db小鼠机体指标的影响。利用桑叶DNJ灌胃Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠(DMT)9周后，与未处理的db/db小鼠(DM)相比，其体重、血糖、血脂及相关生化指标变化显著。DNJ处理对db/db小鼠的体重有一定的控制作用，显著降低了血糖及胰岛素的含量，血糖含量由32.6mM降低为27.6mM，胰岛素含量从67.6mIU/L降低为27.1mIU/L，胰岛素抵抗由97.87降低为33.23，表明DNJ具有降血糖及增加胰岛素敏感性的作用。DNJ显著影响了血清中血脂的含量，TC、TG和LDL分别由4.16mM、2.36mM、3.54mM下降为3.08mM、1.34mM和3.49mM，而HDL由1.06mM升高到1.20mM，表明DNJ对db/db小鼠的血脂有很好的控制作用。DNJ能显著降低db/db小鼠血清中MDA的含量，从26.17nM降低为18.10nM，提高了机体的抗氧化能力;AGEs也表现出下降趋势，减轻了糖尿病并发症的发生。DNJ处理显著降低了血清中Cr的含量，由90.71μM降低到61.17μM，ALT、BUN的含量也有所降低。肝脏细胞H&E染色结果表明DNJ处理可以有效恢复高血糖对小鼠肝脏的损伤。
　　转录水平分析桑叶DNJ降糖降脂机理。肝脏转录组的表达谱结果表明DNJ处理db/db小鼠（DMT组）和未处理db/db小鼠组（DM组）肝脏的差异表达基因2024个，其中DNJ处理后398个基因上调，1626个基因下调。通过GO分析，这些差异表达基因主要富集于的碳水化合物代谢过程、脂质代谢过程、循环系统、免疫系统、转移酶活性、氧化还原酶活性、次级代谢过程等方面;通过KEGG分析，这些差异基因富集于42个信号通路217个代谢途径中，包括碳代谢通路、脂代谢通路、能量代谢通路、氨基酸代谢通路、无机盐运输及信号传导通路。
　　利用定量PCR方法，对糖、脂代谢有关的12个基因和其它的6种酶蛋白基因进行验证。DNJ可以显著降低G6PC基因mRNA的表达，有效降低PEPCK基因的mRNA的表达，有效促进HK的mRNA的表达上调，表明DNJ可以促进糖酵解、抑制糖的异生。脂代谢方面，DNJ可以显著降低脂质代谢相关的SCD、CYP4A、PAP、ATPase、ACADVL、APOA4基因的mRNA的表达量，表明DNJ可能具有减少脂类的生成、减缓脂肪酸的氧化、降低了胆固醇的合成和脂肪的作用。DNJ处理可以显著下降胰岛素分泌通路中CAMK2和ATP1A基因的mRNA表达量，说明DNJ可能具有减少了胰岛素的分泌、降低了胰岛素抵抗的作用。另外，DNJ处理还可以显著降低Apolipoprotein A-Ⅳ、UGT、DPYD、CPS1、AADAT、ALDH6A1和ADCY基因的表达。表明DNJ降低血糖血脂是多个途径共同作用的结果。
　　从尿液代谢组分析桑叶DNJ降糖降脂机理。利用LC-MS分析了DNJ干预的DMT组和未干预的DM组小鼠的尿液，总共鉴定出顺乌头酸、苯乙醛等38个变化显著的代谢物;其中和糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢密切相关有15个差异物。DNJ处理可以显著降低尿液中3-磷酸甘油醛、半乳糖醇的含量，提高顺乌头酸的含量，表明DNJ有促进葡萄糖进入三羧酸循环的作用。DNJ可以显著降低尿液中棕榈酰肉碱、2-Methoxyestrone3-sulfate、乙酰乙酸的含量，表明DNJ减少了脂类和酮体的生成。DNJ能减少尿液中氨基酸代谢物的含量，如精氨基琥珀酸、苯乙胺、苯乙醛、麦芽碱、奎酸、胍基戊酸、哌啶酸、苯酚和15-acetoxy-12，13-epoxy-1等，表明DNJ还能调节氨基酸的代谢。
　　DNJ产生菌的筛选鉴定及产DNJ发酵优化。通过糖苷酶抑制法初筛和液质联用复筛，获得一株糖苷酶抑制剂产生菌。利用质谱及核磁检测解析该抑制剂，确定其为DNJ。通过观察形态、生理生化实验及16S rDNA鉴定，该菌株归属为短小芽孢杆菌，命名为Bacillus pumilus W642。通过单因素实验法初步优化了B.pumilusW642产DNJ的发酵条件，最佳培养基组成为:KNO34％、牛肉膏5％、山梨醇2％、MgSO40.5％、初始pH为7.0，最佳培养条件为:培养温度30℃、150rpm振荡培养3d，发酵液中DNJ产量最高可达210mg/L，比优化前提高了50％。