长链非编码RNA PVT1对miR-30d-5p的调控及其在结肠癌发生发展的作用机制

目录

声明

引 言

1 lncRNA 的研究进展

2 miRNA 的研究进展

3 研究 miRNA 与 lncRNA 相互作用的数据库及软件

4 lncRNA 与 miRNA 相互调控的作用机制

5 长链非编码 RNA 的研究方法

6 PVT1 的研究现状

1 实验材料

1.1 组织标本及细胞系

1.2 引物

1.3 实验仪器

1.4 实验试剂

2 实验方法

2.1 结肠癌及癌旁组织中 PVT1 表达水平的检测

2.1.1 Trizol 法提取人结肠癌及癌旁组织中总 mRNA

2.1.2 分别提取总 mRNA，通过反转录试剂盒反转录成 cDNA

2.1.3 RT-qPCR 反应验证 PVT1 的表达情况

2.1.4 检测完成后对比结肠癌及癌旁组织中 PVT1 表达水平

2.2 细胞培养和传代

2.2.3细胞冻存

2.3 正常人类结肠上皮细胞（NCM460）和结肠癌细胞系 HCT116、H T29、SW620、SW480、Caco2中PVT1表达水平的检测

2.3.1 Trizol 法提取细胞中总 mRNA

2.3.2 分别提取总 mRNA，通过反转录试剂盒反转录成 cDNA

2.3.3 RT- qPCR 反应验证 PVT1 的表达情况

2.3.4 检测完成后对比正常人类结肠上皮细胞（ NCM460）和结肠癌细胞系 HCT1 16、HT29、SW620、SW480、Caco2中 PVT1表达水平

2.4 敲减 PVT1 细胞系的构建

2.4.1 通过靶向 PVT1 的慢病毒 (shRNA)，合成质粒 pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro(BiosettiaInc, San Diego, CA, USA)

2.4.2慢病毒的包装

2.4.3感染目的细胞

2.5 转染慢病毒载体（sh-PVT1）及对照载体（sh-ctrl）的 HCT116 和SW480细胞中PVT1相对表达水平的检测

2.6.1 CCK8

2.6.2 克隆形成实验

2.6.3 Transwell 侵袭实验

2.7 PVT1 下游 miRNA 的查找

2.8 转染慢病毒载体（sh-PVT1）及对照载体（sh-ctrl）的 HCT116 和SW480细胞中miR-30d-5p相对表达水平的检测

2.9 双荧光素酶报告基因实验

2.10 RNA 结合蛋白免疫共沉淀实验(RIP 实验)检测 PVT1 组及对照组细胞中miR-30d-5p的表达水平

三、免疫共沉淀

四、RNA的纯化与分析

2.11 结肠癌及癌旁组织中 miR-30d-5p 表达水平的检测

2.12 统计分析

3 结果

3.1 PVT1 在结肠癌组织及结肠癌细胞系中表达水平

3.2 敲减 PVT1 可抑制细胞的体外增殖和侵袭

3.3 miR-30d-5p 与 PVT1 在结肠癌中的相互作用

4 讨论

5 结论

参考文献