G-四链体级联信号扩增可视化在转基因检测中的应用

摘要

伴随着生物技术的进步，转基因作物在全球范围内得到广泛的种植。转基因技术打破了生殖隔离的限制，使得转基因作物整合了多物种的基因。虽然未有科学数据直接证明，但是转入的外源基因仍然对环境和食品安全构成潜在的威胁。所以对于转基因作物以及相关产品的安全性评价、监管和检测显得尤为重要。
　　本论文主要研究利用新型核苷酸探针和DNA扩增方法联用对转基因成分进行检测的方法。在研究过程中，使用核苷酸探针与DNA扩增方法联合使用，并探索出合适的体系，以及联用体系在不同条件下的通用性。
　　通过设计一段包含G-四链体互补序列的特异性探针用于等温扩增方法，对含Bt基因部分序列的单链DNA分子进行可视化检测。通过优化，确定了1μL10XIsothermal Amplification和0.5μL10X NEBuffer3.1、10mM Mg2+、4μM Hemin、5UNb.BbvCI、4U Bst2.0 WarmStar，并使用三片层的分子内G-四链体探针作为最优反应体系，孵育60min完成对目的基因的检测。建立了一种简单的，无需标记的G-四链体等温扩增检测体系。
　　进一步通过将G-四链体核苷酸探针和两种DNA扩增方法联用。以转基因水稻科丰6号基因组DNA作为对cry1Ab/cry1Ac基因检测的目标DNA，为了降低背景信号对检测结果的影响，使用初始1μM浓度的含有分子内G-四链体结构的引物进行PCR反应。当体系内存在存在cry1Ab/cry1Ac基因的植物基因组DNA时，会通过PCR和等温扩增的反应过程，使体系内积累大量的G-四链体，并通过显色系统使本来无色的溶液变成蓝绿色。基于此，建立了一种可以直接从转基因实际样品中检测cry1Ab/cry1Ac基因的可视化检测方法。
　　除此之外，还探索了级联扩增方法在检测其他转基因作物样品时，特别是具有复杂基因组结构的转基因玉米MON89034的检测效果。使用5μL和2μL的对应各自检测体统的引物分别用于Nb.BbvCI和Nt.BstNBI检测体系的PCR过程，之后再分别在37℃和55℃酶的最适温度下孵育30min。最终Nb.BbvCI体系和Nt.BstNBI体系分别对MON89034的检出限为100拷贝和50拷贝，达到了转基因检测的要求。因此，建立了一种选择性好，并且具有通用性的可视化转基因检测方法。

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致谢

摘要

第一章 引言

1．1 转基因作物检测研究进展

1．1．1 转基因作物发展概况

1．1．2 转基因作物安全与标识概况

1．1．3 转基因检测技术概况

1．2 G-四链体的研究进展

1．2．1 G-四链体的介绍

1．2．2 G-四链体的拓扑构型

1．2．3 研究G-四链体结构的方法

1．2．4 G-四链体的应用

1．2．5 G-四链体与DNA扩增技术联用研究进展

1．3 本文研究的主要目的和意义

第二章 G-四链体与等温扩增联用转基因检测方法的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 仪器

2．1．2 试剂

2．1．3 引物设计

2．1．4 G-四链体和等温扩增结合检测体系

2．1．5 G-四链体和等温扩增结合检测方法灵敏度

2．2 结果与分析

2．2．1 G-四链体和等温扩增结合检测方法的建立

2．2．2 G-四链体和等温扩增结合检测方法灵敏度分析

2．2．3 条件优化

2．3 本章小结

第三章 G-四链体级联信号扩增可视化检测转基因植物方法研究

3．1 材料与分析

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．1．3 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 引物浓度的优化

3．2．2 G-四链体类型的影响

3．2．3 G-四链体级联信号扩增检测cry1Ab／cry1Ac基因方法的建立

3．2．4 G-四链体级联信号扩增检测cry1Ab／cry1Ac基因灵敏度分析

3．2．5 G-四链体级联信号扩增检测cry1Ab／cry1Ac基因的特异性

3．3 本章小结

第四章 G-四链体级联信号扩增可视化检测方法的通用性研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 仪器

4．1．3 试剂

4．1．4 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 引物浓度优化

4．2．2 不同酶体系的G-四链体级联信号扩增检测系统的建立

4．2．3 不同酶的G-四链体级联信号扩增检测体系灵敏度分析

4．2．4 不同酶的G-四链体级联信号扩增检测体系特异性分析

4．3 本章小结

总结与展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文