原癌基因GFRa1去甲基化激活与食管癌、结肠癌转移及预后的相关性研究

摘要

目的：　　GFRa1在多种肿瘤中表达上调，已知在胃癌组织中GFRa1存在去甲基化激活，促进胃癌的发生和转移，缩短患者的总生存时间。本研究在食管癌和结肠癌组织中分析GFRa1去甲基化情况与肿瘤转移和患者预后的相关性，为GFRa1去甲基化可能成为预测肿瘤转移和预后的标志物提供理论依据。　　方法：　　挑选食管癌患者石蜡包埋标本90例(淋巴结转移组42例，非转移组48例)，结肠正常组织15例及结肠癌患者新鲜组织93例(淋巴结转移组49例，非转移组44例)，收集患者临床病理资料及至少3年的随访记录。酚氯仿法提取食管癌和结肠癌组织DNA，进行亚硫酸氢钠修饰；MethyLight法和DHPLC法检测食管癌及结肠癌组织中GFRa1去甲基化情况；RT-PCR检测组织中GFRa1 mRNA表达水平；Werstern Blot检测结肠组织中GFRa1蛋白表达水平。培养人结肠癌细胞系HCT116，将实验室前期构建好的GFRa1表达载体GFRa1b-pcDNA3.1 B瞬时转染至细胞中，用长时间活细胞动态监测仪观察GFRa1b对肿瘤细胞生长能力的影响。利用SPSS17.0软件进行统计学处理，对GFRa1去甲基化情况与食管癌及结肠癌患者的术后总生存时间进行Kaplan-Meier分析，明确GFRa1去甲基化情况与肿瘤患者预后是否相关。　　结果：　　一、GFRa1去甲基化激活与食管癌患者转移及预后的相关性研究　　1.转移组GFRa1去甲基化阳性率(78.57％)显著高于非转移组(41.67%)，差异有统计学意义(P<0.05)。　　2.GFRa1去甲基化阳性组mRNA相对拷贝数(0.10)显著高于去甲基化阴性组(0.02)，差异有统计学意义(P<0.05)。　　3.低分化的癌组织中GFRa1去甲基化阳性率(70.8%)高于中高分化的癌组织(45.2%)，差异有统计学意义(P<0.05)。　　4.GFRa1去甲基化阳性患者的术后总生存时间明显低于去甲基化阴性的患者(Log-rank test，P<0.001)，3年生存率分别为25.0%和64.9%。　　二、GFRa1去甲基化激活与结肠癌患者发生、转移及预后的相关性研究　　1.正常结肠组织中GFRa1去甲基化含量(中位数41.88%)低于结肠癌组织(54.45%)，差异有统计学意义(P<0.05)。　　2.GFRa1去甲基化阳性组mRNA相对拷贝数(0.01)显著高于去甲基化阴性组(0.0004)，差异有统计学意义(P<0.05)。　　3.淋巴结非转移组中 GFRa1去甲基化含量(88.21%)低于淋巴结转移组(91.66%)，差异无统计学意义。　　4.低分化的癌组织中 GFRa1去甲基化含量(95.46%)显著高于中高分化的癌组织(89.31%)，差异有统计学意义(P<0.05)。　　5.去甲基化阳性组GFRa1蛋白含量高于去甲基化阴性组。　　三、GFRa1b对肿瘤细胞生长的影响　　1.构建GFRa1b的表达载体，转染结肠癌细胞系HCT116细胞24小时后，细胞增殖能力显著增强。　　结论：　　原癌基因GFRa1去甲基化激活可促进哈萨克族食管癌患者肿瘤淋巴结转移，并且缩短患者的术后生存时间；GFRa1去甲基化激活与结肠癌的发生正相关，过表达GFRa1b明显促进肿瘤细胞的生长。

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前言

实验材料

1. 组织标本

2.细胞系和质粒

3.仪器

4.实验所用材料

实 验 方 法

1.组织和细胞系的DNA提取及浓度测定

2. DNA亚硫酸氢钠修饰及纯化

3.组织RNA的提取

4.组织中蛋白质的提取

5. cDNA合成及逆转录

6.细胞培养

7.细胞转染

8. 长时间活细胞动态监测系统检测细胞增殖能力

9. 实时定量RT-PCR

10.Western blot

11. MethyLight分析

12. 变性高效液相色谱(DHPLC)

13. 统计方法

结果

1. GFRa1去甲基化对新疆哈萨克族食管癌患者肿瘤转移及预后的影响

2. GFRa1去甲基化对结肠癌发生、转移及预后的影响

讨论

结论

参考文献

综述:神经胶质细胞来源的神经营养因子及其受体与肿瘤的关系

致谢

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