基于斑块稳定性指标探讨青龄与老龄ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化特点

摘要

目的：　　动脉粥样硬化(AS)是一种主要累及大、中动脉的慢性进展性的血管病变，它导致受累脏器缺血乃至坏死，其中冠状动脉粥样硬化所致的冠心病是引起患者死亡的主要原因之一。冠状动脉粥样硬化斑块不稳定，发生破裂进而诱发血栓形成是导致急性心血管事件的主要病理生理机制。随着老龄化社会的到来，老龄冠心病患者明显增加，且预后差。年龄是AS发生的独立危险因素，但其对AS斑块稳定性的影响尚未完全阐明，影响临床对老龄冠心病患者的诊疗。因此，本课题拟从AS斑块稳定性的相关指标着手，探讨青龄与老龄小鼠冠状动脉粥样硬化斑块稳定性的差异及存在差异的可能机制。　　故本课题的研究目的为：　　(1)建立青龄及老龄载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠冠状动脉粥样硬化斑块模型，通过横向对比青龄与老龄小鼠冠状动脉粥样硬化斑块形态学差异，明确老龄对AS斑块进展的促进作用。　　(2)在明确青龄与老龄ApoE-/-小鼠冠状动脉粥样硬化斑块存在形态学差异的基础上，进一步比较分析青龄及老龄ApoE-/-小鼠AS斑块稳定性的差异，并探讨出现差异的机制是否与老龄影响机体脂质代谢紊乱、血管功能失调和炎症免疫改变等有关。　　最终，为基础研究选择合适的ApoE-/-小鼠冠状粥样硬化模型提供实验依据，为进一步寻找针对不同年龄段人群抗AS的药物治疗和干预靶点提供实验支持。　　方法：　　采用5周龄和32周龄ApoE-/-雄性小鼠各20只，分别作为青龄模型组(QM)和老龄模型组(LM)，并选取同遗传背景的5周龄和32周龄C57BL/6J雄性小鼠各10只，分别作为青龄对照组(QC)和老龄对照组(LC)。小鼠适应性饲养一周后，将ApoE-/-小鼠作为模型动物，C57BL/6J小鼠作为对照动物，分别随机分笼饲养，均为每笼5只。模型组小鼠始终给予高脂饲料MD12015（包括21%乳脂、0.15%胆固醇）、对照组则给予普通饲料。在造模过程中，每周观察小鼠体重变化、精神状况及饮食量等一般情况，及时发现异常小鼠并从实验组剔除，全程共干预28周。干预结束后，行小动物彩超仪测定斑块位置及大小等；称取小鼠体重，全部小鼠目内眦取血后，用生理盐水进行灌注（至肝脏变白、流出液变清为止），取出、剥离主动脉（体视镜下）及心底部组织固定或分装备用。取心底部心肌组织行HE染色，观察主动脉根部水平的冠状动脉主干AS斑块形成情况，并通过Leica Qwin Image Processing and Analysis软件分析计算AS斑块面积、内外膜炎细胞数等，对比分析青龄小鼠与老龄小鼠冠状动脉AS斑块的形态学差异。离心取血清，通过生化法检测血脂水平，酶联免疫法(ELISA)检测血清趋化因子MCP-1的水平。取心脏近主动脉根部心肌组织行油红O染色，测量冠状动脉AS斑块内脂质含量；行普鲁士蓝染色，观察冠状动脉AS斑块内出血，评估斑块内病理性血管新生情况；行Masson染色，计算冠状动脉AS斑块内胶原纤维含量；行免疫组化染色，观察冠状动脉AS斑块内CD68、MMP9的表达情况；并用RT-PCR法检测主动脉中ICAM-1及VCAM-1 mRNA的表达，蛋白印迹法检测冠状动脉中ICAM-1及VCAM-1蛋白的表达。　　结果：　　1．一般情况观察：实验28周结束后，观察一般情况，高脂膳食饲养的雄性ApoE-/-小鼠较同年龄段的对照组小鼠相比可见：普遍体态肥胖、体重增加(p＜0.05)，其中部分老龄ApoE-/-小鼠出现局部毛发脱落、行动迟缓，而其余组别外观无明显异常。　　2．小动物彩超仪观察：彩超仪观察可见两年龄段模型组小鼠主动脉弓部及颈动脉部均可见明显斑块，相应对照组小鼠均无明显斑块形成。　　3．小鼠血脂水平的改变：ApoE-/-小鼠饲以高脂饮食28周后，模型组小鼠和同年龄段对照组小鼠相比，血清TG、TC、LDL-C水平升高，且差异均有显著性(p＜0.05)；LM组小鼠血清HDL-C水平较LC组降低，且有统计学意义(p＜0.05)；QM组较QC组相比，小鼠血清HDL-C水平有下降趋势，但差异无统计学意义(p＞0.05)。　　4．冠状动脉AS斑块的观察　　4.1.HE染色形态学观察及斑块数据分析：通过光学显微镜观察各组ApoE-/-小鼠主动脉根部水平冠状动脉HE染色发现，QC组冠状动脉管壁结构规则，内膜平滑、中膜厚度均一、管腔近圆形。LC组冠状动脉管壁较疏松，内、外弹力板清晰可见，管腔规整。QM组冠状动脉管壁部分结构凌乱、弹性膜结构破坏，管壁内可见偏心性AS斑块，其纤维帽完整，斑块内及外膜可见较多炎性细胞浸润。LM组管壁结构明显紊乱，弹性膜结构明显减少，内膜明显增厚，并见有大量泡沫细胞、炎性细胞浸润，管腔狭窄，部分纤维帽破裂。两年龄段对照组冠状动脉均无斑块形成，外膜亦无炎细胞浸润。　　通过Leica Qwin Image Processing and Analysis软件分析发现，LM与QM相比，ApoE-/-小鼠主动脉根部冠状动脉校正斑块面积具有显著性差异(p＜0.05)；LM内膜最长径为（193±43）μm，与QM（126±21.1）μm相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；LC中膜面积（44.49±3.59）%，与QC中膜面积（40.85±2.10）%相比，差异有显著性(p＜0.05)；LM中膜面积(39.09±3.65)%，与QM中膜面积（35.72±4.64）%相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)；两年龄段模型组分别与相应同年龄段对照组相比，结果显示中膜面积百分比均减小，减小幅度分别为13.8%、14.4%(p＜0.05)；LM与QM相比斑块内炎细胞数未见明显差异(p＞0.05)，外膜炎细胞浸润增多，且有统计学差异(p＜0.05)，增多幅度达35.8%。　　4.2.斑块成分分析：油红O染色结果显示，两年龄段模型组管壁一侧细胞内可见有较多脂质积聚形成的脂滴，LM较QM相比脂质含量百分比无明显统计学差异(p＞0.05)。Masson染色显示，两年龄段模型组小鼠冠状动脉可见明显AS斑块，且斑块内可见大量胶原纤维，LM与QM相比，斑块内胶原纤维含量百分比明显减少，有统计学差异(p＜0.05)。普鲁士蓝染色显示，两年龄段模型组冠状动脉AS斑块中均可见普鲁士蓝染色阳性颗粒，且QM较LM相比数量明显增多，校正百分比有统计学意义(p＜0.05)。　　4.3.免疫组化检测斑块中相关蛋白表达：两年龄段对照组小鼠冠状动脉均无AS斑块形成，LM与QM相比斑块内CD68阳性细胞个数及MMP9阳性面积百分比增多，有明显统计学差异(p＜0.05)。　　5．RT-PCR检测相关基因的表达：与同年龄段对照组相比，模型组ICAM-1、VCAM-1的表达水平均明显升高，且有统计学差异(p＜0.05)；另LM较QM、LC较QC相比，ICAM-1的表达升高，差异有统计学意义(p＜0.05)，除了VCAM-1的表达在QC高于LC，余趋势与ICAM-1基本一致。　　6．蛋白印迹法检测蛋白的表达：与同年龄段对照组相比，LM与QM的ICAM-1蛋白表达均增加，有统计学差异(p＜0.05)，而VCAM-1在QM与QC相比时差异有统计学意义(p＜0.05)，在LM与LC相比时无统计学差异(p＞0.05)。　　结论：　　1．给予ApoE-/-小鼠28周的高脂饮食可以成功复制出冠状动脉粥样硬化模型。　　2．在相同周期的高脂饮食条件下，青龄与老龄ApoE-/-小鼠AS病程不同，AS的形态学特征及稳定性指标均存在一定差异。　　3．老龄ApoE-/-小鼠AS斑块的不稳定性主要与内外膜炎症反应、细胞外基质降解有关，而青龄ApoE-/-小鼠AS斑块的不稳定性则主要与斑块内出血密切相关。

目录

第一个书签之前

ABSTRACT

英文缩略词表

动脉粥样硬化

急性心血管事件

急性冠脉综合征

冠心病

缺血性心脏病

细胞间黏附分子-1

白介素1-β

基质金属蛋白酶9

甘油三酯

总胆固醇

VEGF

蛋白印迹法

实验一 评估靑龄及老龄ApoE-/-小鼠冠状动脉粥样硬化斑块

1.材料与方法

高脂饲料：即MD12015，成分包括21%乳脂、0.15%胆固醇，用于喂养模型组小鼠。

3.小结

影像学及形态学结果显示，同时暴露在一定周期的高脂饮食条件下，老龄ApoE-/-小鼠与青龄ApoE-/

1.材料与方法

引物设计：

针对目的基因序列，运用NCBI中Primer-Blast功能，设计特异性引物序列，由上海生物工程有限

2.实验结果

结论

本实验的不足之处

下一步的研究计划

参考文献

附录

综述

年龄对动脉粥样硬化影响相关因素的研究进展

1．年龄与低密度脂蛋白（LDL）

2．年龄与炎症反应

3.年龄与骨桥蛋白（OPN）

4．年龄与胰岛素样生长因子-1（IGF-1）

5.治疗

6.总结与展望