补肾调冲方对DOR小鼠体外成熟卵母细胞质量及胚胎发育潜能的影响

摘要

目的：观察不同浓度的BDNF对小鼠体外成熟卵母细胞质量及胚胎发育潜能的影响，选取最佳培养浓度，以BDNF为对照，进一步研究补肾调冲方对DOR小鼠体外成熟卵母细胞质量及胚胎发育潜能的影响，为中医应用“肾主生殖”及“冲任学说”治疗DOR提供更有力的依据。　　方法：　　1.实验一：选取SPF级8-10周龄ICR雌性小鼠40只，每只小鼠在动情前期注射孕马血清(PMSG)IO IU，48小时后处死，采集其未成熟卵母细胞，分别用含有Ong/ml、 lng/ml、5ng/ml、10ng/ml(分别为 BDNF-0组、BDNF-1组、BDNF-5组、BDNF-10组)的BDNF培养液体外培养24小时。利用PCR方法检测卵母细胞内mt DNA拷贝数，采用线粒体荧光探针（mitotracker)检测线粒体定位，采用FITC-PNA对皮质颗粒进行荧光染色，观察皮质颗粒分布。选取SPF级10-12周龄昆明种雄性小白鼠，将雄鼠颈椎脱臼处死，剪碎附睾尾取精，精卵体外受精培养。受精后观察卵母细胞受精、2-细胞及囊胚形成情况。　　2.实验二：选取SPF级8-10周龄ICR雌性小鼠40只，按体重分层法随机分配，每组各10只，分为空白组、模型组、BDNF组、中药组。动物模型采用Cy进行造模，模型组、BDNF组和中药组腹腔内一次性注射Cy75mg/kg。空白组、模型组、BDNF组小鼠每日给予生理盐水12mg/kg，中药组小鼠每日给予补肾调冲方水煎剂20mg/kg/d(相当于成人临床等效剂量，按照小鼠体重系数换算）。各干预措施均采用灌胃方式给药，连续4周。每只小鼠在动情前期注射PMSG10IU，48小时后处死，采集其未成熟卵母细胞，空白组、模型组、中药组在KSOM-AA培养液中进行培养，BDNF组在培养液中添加5ng/ml的BDNF进行培养，各组均培养24小时。利用PCR方法检测卵母细胞mt DNA拷贝数，采用线粒体荧光探针(mitotracker)检测线粒体定位，采用FITC-PNA对皮质颗粒进行荧光染色，观察皮质颗粒分布。选取SPF级10?12周龄昆明种雄性小白鼠，将雄鼠颈椎脱白处死，剪碎附睾尾取精，精卵体外受精培养。受精后观察卵母细胞受精、2-细胞及囊胚形成情况。　　结果：　　1、实验一　　1.1各组小鼠体外成熟卵母细胞质量比较：（l)mtDNA拷贝数：各组的mtDNA拷贝数相比差异无统计学意义。（2)线粒体定位：BDNF-5组和BDNF-10组中IVM卵母细胞的线粒体均匀分布的比例分别显著高于BDNF-0组和BDNF-1组。BDNF-0组与 BDNF-1组、BDNF-5组与BDNF-10组组间相比差异均无统计学意义，BDNF-0组与 BDNF-5组、BDNF-0组与 BDNF-10组、BDNF-1组与 BDNF-5组、BDNF-1组与 BDNF-10组组间相比差异均有统计学意义。（3)皮质颗粒分布：BDNF-5组和BDNF-10组皮质颗粒呈III级分布的比率明显高于BDNF-0组和BDNF-1组。BDNF-0组与BDNF-1组、 BDNF-5组与BDNF-10组组间相比差异均无统计学意义，BDNF-0组与BDNF-5组、 BDNF-0组与 BDNF-10组、BDNF-1组与 BDNF-5组、BDNF-1组与 BDNF-10组组间相比差异均有统计学意义。　　1.2各组小鼠卵母细胞发育能力的比较：（1)卵母细胞受精率：各组相比差异无统计学意义。（2)2-细胞率和囊胚率：BDNF-5和BDNF-10组的IVM卵母细胞的2-细胞率和囊胚率显著高于BDNF-0组和BDNF-1组。BDNF-0组与BDNF-1组、BDNF-5组与BDNF-10组组间相比差异均无统计学意义，BDNF-0组与BDNF-5组、BDNF-0组与 BDNF-10组、BDNF-1组与BDNF-5组、BDNF-1组与BDNF-10组组间相比差异均有统计学意义。　　2、实验二　　2.1补肾调冲方对各组小鼠体外成熟卵母细胞质量比较：（1) mtDNA拷贝数：空白组、 BDNF组、中药组mtDNA拷贝数均明显高于模型组，相比差异有统计学意义。空白组、 BDNF组、中药组三组之间两两比较差异均无统计学意义。（2)线粒体定位：空白组、 BDNF组、中药组线粒体均匀分布比例均明显高于模型组，相比差异均有统计学意义。空白组、BDNF组、中药组三组之间两两比较差异均无统计学意义。（3)皮质颗粒分布：空白组、BDNF组、中药组皮质颗粒处于III级分布的比例明显高于模型组，相比差异均有统计学意义。空白组、BDNF组、中药组三组之间两两比较差异均无统计学意义。　　2.2各组小鼠卵母细胞发育能力的比较：（1)卵母细胞受精率：空白组、BDNF组、中药组的受精率均较模型组明显增高，相比差异均有统计学意义；空白组、BDNF组、中药组三组之间两两比较，差异均无统计学意义。（2)2-细胞率和囊胚率：空白组、 BDNF组、中药组的受精率均较模型组明显增高，相比差异均有统计学意义；空白组、 BDNF组、中药组三组之间两两比较，差异均无统计学意义。　　结论：　　1.BDNF可以促进外成熟卵母细胞细胞质的成熟，提高卵母细胞质量。　　2.BDNF可以提高胚胎发育潜能。　　3.经过不同浓度对比，体外成熟培养液中添加5ng/ml的B D N F即可提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能。　　4.补肾调冲方和BDNF均可以促进D O R小鼠体外成熟卵母细胞质成熟，提高卵母细胞质量。　　5.补肾调冲方和BDNF均可以提高D O R小鼠胚胎发育潜能。　　6.在提高IVM中卵母细胞质量和胚胎发育潜能方面，补肾调冲方与BDNF具有相似的效果，为中医“肾主生殖”及“冲任学说”提供理论依据，也为临床上中医药治疗DOR、介入辅助生殖技术提供了新的科学依据。

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中文摘要

英文摘要

英文缩略词表

前言

技术路线图（一)

技术路线图（二)

实验一不同浓度BDNF对小鼠体外成熟卵母细胞质量及胚胎发育潜能的影响

1 材料与方法

2 实验结果

3 小结

实验二 补肾调冲方对DOR小鼠体外成熟卵母细胞质量和胚胎发育潜能的影响

1 材料与方法

2 实验结果

3 小结

讨论

1 BDNF与DOR的相关研究

2 BDNF对体外成熟卵母细胞质量的影响

3 BDNF对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育潜能的影响

4 中医对女性生殖轴的认识

5 补肾调冲方的组方意义及药物分析

结论

参考文献

综述一:女性生殖理论在IVF-ET中的应用

1 “肾一天癸一冲任一胞宫”轴与女性生殖

2 中医生殖理论在IVF-ET中的应用

3 结语

参考文献

综述二: BDNF及其受体在女性生殖系统中的作用

1 BDNF及TrkB对卵泡发育的影响

2 BDNF对卵母细胞成熟及移植前胚胎发育的作用

3 BDNF对排卵障碍性不孕的影响

4 BDNF与女性生育结局

5 展望

参考文献

致谢

个人简历