复方莪术散调控子宫内膜异位症大鼠模型细胞周期蛋白E(Cyclin E)及P27的表达

摘要

目的：探讨细胞周期素E与P27蛋白在大鼠子宫内膜异位症中的表达及意义；观察复方莪术散对细胞周期蛋白E(Cyclin E)及P27在子宫内膜异位症大鼠异位内膜表达的影响，从细胞周期调控的角度探讨复方莪术散治疗子宫内膜异位症的相关机制。　　方法：　　1.选取健康成熟未交配的清洁级雌性Wistar大鼠60只，每只体重均在(200士20)g，不检测其动情期，采用自体移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型，测量其移植物大小，观察其形态。建模4周后二次剖腹，根据模型情况选择纳入与排除，将成膜无差别的大鼠随机分为4组：复方莪术散高剂量组，复方莪术散低剂量组，孕三烯酮组及模型观察组，同时设置正常大鼠在位内膜为空白对照组。　　2.分别给药4周后，于末次给药24小时内，腹腔麻醉大鼠，第三次剖腹，检测移植物体积和重量，剥离种植的异位病灶及相应的一段在位子宫内膜制作标本，进行HE染色，光镜下观察其病理组织形态。　　3.免疫组织化学方法(SP法)测定CyclinE和P27蛋白在大鼠复方莪术散组、孕三烯酮组、模型观察组及空白对照组不同子宫内膜组织中的表达。　　结果：　　1.不检测动情期造模4周后，第二次剖腹证实，采用自体移植法复制 EMs大鼠模型，其成模率为84.1％。生长良好的异位病灶表现：隆起的囊泡状结构，内部可见大量积液，丰富血管走行于病灶表面。病理学检查：子宫内膜上皮细胞、腺体和间质组织生长。　　2.造模4周后，模型观察组移植内膜体积较大，腹腔粘连严重。复方莪术散(EZP)干预后体积明显减小，腹腔粘连减轻。用药前各组大鼠异位病灶体积比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；分组给药4周后，第三次剖腹发现模型观察组异位病灶体积较造模4周时明显增大，差异有统计学意义(P＜0.05)，EZP高剂量组异位病灶体积与模型观察组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；EZP低剂量组异位病灶体积与模型观察组相比，无明显统计学差异（P>0.05）；孕三烯酮组异位病灶体积与模型观察组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；EZP高剂量组与孕三烯酮组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。　　3.分组给药4周后，EZP高剂量组异位病灶重量与模型观察组相比明显减轻，差异有统计学意义(P<0.05)，与孕三烯酮组异位病灶重量比较，无明显统计学差异(P>0.05)；EZP低剂量组异位病灶重量与模型观察组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。　　4.从组织形态学来看，光镜下观察模型观察组、EZP各剂量组及孕三烯酮组移植的子宫内膜组织均成活，形成的囊壁由内向外分别为上皮层、粘膜层及少量纤维结缔组织。模型观察组异位内膜上皮层呈高柱状，粘膜层内间质致密，血管丰富，腺体数量较多，扩张状，腺腔大。相对于模型观察组，各给药组可见不同程度萎缩的异位内膜组织，腺体面积缩小，数量减少。可见变薄的被覆上皮。可见低柱状与扁平状的上皮细胞，呈松散排列。间质细胞明显减少，血管数目减少。与正常大鼠子宫内膜相比， EZP组在位内膜的腺体数量、面积及腺上皮细胞和间质细胞的形态并无明显改变。　　5.免疫组化技术检测CyclinE蛋白阳性表达主要位于子宫内膜细胞核上，在模型观察组中异位、在位子宫内膜及空白对照组子宫内膜中均可检测到 CyclinE蛋白表达。CyclinE在模型观察组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（88.9%）较其在空白对照组（在位子宫内膜）中（10%）明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；CyclinE在EZP高剂量组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（22.2%）、在孕三烯酮组（异位子宫内膜）中其阳性表达率(33.3%)较其在模型观察组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（88.9%）明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；CyclinE在低剂量组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（60%）较其在模型观察组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（88.9%）降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。　　6.免疫组化技术检测 P27蛋白阳性表达主要位于子宫内膜细胞核上，在模型对照组中异位、在位子宫内膜及空白对照组子宫内膜中均可检测到P27蛋白表达。P27在模型观察组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（22.2%）较其在空白对照组（在位子宫内膜）中（80%）明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；P27在 EZP高剂量组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（77.8%）、在孕三烯酮组（异位子宫内膜）中其阳性表达率(77.8%)较其在模型观察组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（22.2%）明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；P27在低剂量组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（40%）较其在模型观察组（异位子宫内膜）中其阳性表达率（22.2%）有所升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。　　7.细胞周期素E与P27蛋白在子宫内膜异位症组中的表达呈负相关(P<0.05)。　　结论：　　1.复方莪术散可抑制大鼠子宫内膜异位症的发展，减小移植物体积和重量。促进异位病灶的萎缩吸收，减轻腹腔粘连，改善异位内膜组织的病理变化，其中以复方莪术散高剂量组最为明显，对在位内膜组织无明显影响。　　2.大鼠异位内膜组织中CyclinE高表达与P27低表达，与子宫内膜异位症的发生、发展关系密切，CyclinE和P27在异位内膜组中表达呈负相关，说明两者具有反向协同作用，表明单一的CyclinE高表达或者 P27低表达，可能不足以导致内异症的发生，而需要两者协同或者其他更多基因的共同作用。　　3.复方莪术散能够下调CyclinE在大鼠异位内膜组织中的表达，升高P27的表达，调控细胞周期，使得异位内膜细胞的增殖与存活受到限制从而使病灶萎缩。因此认为复方莪术散抑制大鼠子宫内膜异位症发展和治疗子宫内膜异位症的机制，可能与改变异位内膜细胞周期密切相关。这一研究结果为我们在细胞增殖方面研究内异症提供了新的理论依据，为我们今后研究从分子靶向方面来治疗子宫内膜异位提供了又一个新的靶点，同时可能是复方莪术散治疗内异症的另一个作用机制。

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英文缩略词表

综述

参考文献

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

实验一复方莪术散对子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜组织形态学的影响

1. 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验药物和试剂

1.3 实验器械与材料

1.4 实验仪器

1.5 实验方法

2. 结果

2.1 各组大鼠体重增长情况

2.2 复方莪术散对大鼠异位子宫内膜（移植物）外观的影响

2.3 复方莪术散对大鼠异位子宫内膜（移植物）体积的影响

2.4 复方莪术散对大鼠异位子宫内膜（移植物）重量的影响

2.5 复方莪术散对大鼠异位子宫内膜组织结构的影响

3. 讨论

3.1 子宫内膜异位症动物模型的建立

3.2 中医药对子宫内膜异位症病机的认识

3.3 复方莪术散的治疗作用

3.4 复方莪术散对异位病灶的病理组织学改变

4. 小结

实验二复方莪术散调控子宫内膜异位症大鼠模型细胞周期蛋白E(Cyclin E)及P27的表达

1. 对象和方法

1.1 研究对象

1.2 主要实验试剂

1.3 主要试剂的配制

1.4 主要仪器和设备摇床MAXQ4450

1.5 免疫组化测定

1.6 阳性结果判定标准

2. 结果

2.1 复方莪术散对EMs大鼠异位组织Cyclin E表达的影响

2.2 复方莪术散对EMs大鼠异位组织P27表达的影响

2.3 CyclinE与P27的相关性分析

3. 讨论

3.1 CyclinE的结构与功能

3.2 P27的结构与功能

3.3 CyclinE在不同子宫内膜组织中的表达及意义

3.4 P27蛋白在不同子宫内膜组织中的表达及意义

3.5 CyclinE与 p27 在子宫内膜异位症中表达的的相关性

3.6 复方莪术散调控子宫内膜异位症大鼠模型细胞周期蛋白E(Cyclin E)及P27的表达

4. 小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文情况