E2F3基因沉默对前列腺癌PC3细胞系细胞周期和细胞凋亡的影响

摘要

前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，在欧美等国发病率较高，我国发病率较低，但近年有上升的趋势。目前对早期前列腺癌(≤T2 N0 M0，B期)患者主要的治疗方法有观察等待，新辅助内分泌治疗和辅助内分泌治疗，前列腺癌根治性切除术，内放射或是外放射治疗；局部进展期前列腺癌(T3 N0 M0，C期)患者大部分人认为不宜接受前列腺根治手术；晚期前列腺癌(≥T3，≥N1或M1，≥D1期)患者则采用单存去势治疗与联合内分泌治疗，连续性内分泌治疗和间歇性内分泌治疗。尽管内分泌治疗，放射治疗等可预防和延缓前列腺癌复发和进展，然而内分泌治疗后，多数前列腺癌转化为激素难治性前列腺癌，临床迫切需要新治疗方法。随着肿瘤学，免疫学以及分子生物学的发展，基因治疗已经成为人类彻底治愈肿瘤提供了新的希望。目前基因治疗中有效的靶点及治疗方法的选择是基因治疗应用于临床的障碍，而RNA干扰(RNA interference，RNAi)的发现为寻找基因治疗的靶点带来了新思路。　　 RNAi是一种在动植物中广泛存在的，由双链RNA诱发的，同源mRNA特异性沉默的过程，包括小干扰RNA生成的起始阶段及靶mRNA降解的效应阶段。RNAi现象是指内源性和外源性双链RNA与细胞内同源序列mRNA相结合并使之降解的现象，是一种序列特异的转录后基因沉默，其作用相当于基因剔除，导致相应基因的表型缺失。与常规技术相比，RNAi优点投入少，周期短，操作简单易行。这无疑是一种快速有效的鉴定基因功能的方法，为基因研究功能开辟了新途径，可用来研究细胞信号转导通路和细胞生长分化过程，更好的了解肿瘤的生物学特征。目前RNAi技术已经广泛应用到肿瘤的研究中。　　 肿瘤的发生和发展与细胞周期调节失控关系密切。E2F最初作为腺病毒E2启动子的活化剂被发现。E2F家族在细胞被证实在细胞周期调控中起重要作用。E2F基因异常表达促使细胞多度增殖和恶性转化。研究发现E2F在前列腺，乳癌等肿瘤有异常的表达。为了探索E2F3在细胞周期调控过程中是否起关键作用，能否作为前列腺癌基因治疗的新靶点，应用RNAi的方法以E2F3基因为靶点进行前列腺癌基因治疗能否有效的抑制肿瘤细胞的增殖。　　 腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体是近年来研究最为广泛、最受关注的基因治疗载体。由于其宿主范围广、免疫原性低、安全性高、稳定性好等特点，AAV载体被认为是未来基因治疗中病毒载体。至今，AAV载体已被用于对各种不同抗血管生成基因行动物肿瘤模型的治疗，其结果显示应用前景非常好。　　 目的：本实验应用RNAi的方法，以AAV为载体，以E2F3基因为治疗靶点针对前列腺癌PC3细胞中异常表达的E2F3基因进行基因沉默，观察肿瘤细胞的细胞变化情况，以明确E2F3基因沉默能否有效调控细胞周期，诱导细胞凋亡。初步探讨E2F3作为靶基因进行特异性干扰的可行性。　　 方法：本实验转染所用AAV病毒由胡海龙博士提供。本实验首先应用光学显微镜对培养细胞进行观察，从以下几个方面来了解细胞生长情况：细胞大小、细胞胞浆内的颗粒、细胞核染色质、细胞间隙、细胞碎片、细胞贴壁和培养液情况等；将不同剂量pAAV-siRNA-E2F3转染入前列腺癌细胞株中，确定转染最佳的的病毒滴度和转染时间；应用倒置显微镜对转染后的细胞观察其绿色荧光表达的情况，以了解病毒的转染效率；应用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期变化情况。所得数据用统计软件SPSS16进行统计处理。　　 结果：无处理细胞组细胞贴壁生长，生长状况良好，空病毒对细胞生长也有轻微影响，而重组AAV组PC3细胞数量明显减少，形态不规则，细胞明显皱缩，颗粒增多，细胞间隙增大，有大量细胞碎片出现，而且少量细胞漂浮于培养液中；重组AAV转染最佳MOI值为1×105v.p./cell，其转染后可见荧数目最多，最佳转染时间为1h；重组AAV转染后30-60分钟即可观察到绿色荧光的表达，转染至72h时约有60％以上的前列腺癌PC3细胞有绿色荧光的表达；流式细胞仪检测细胞周期数据结果：未处理细胞组G1期与S期为(30.20±9.08)％、(58.30±3.22)％；转染空病毒组的PC3细胞G1期与S期分别为(32.07±3.21)％、(57.64±3.58)％；而重组AAV组分别为(79.59±5.01)％、(13.08±0.58)％，未处理细胞组和空病毒组相比差异无统计学意义(P>0.05)；未处理细胞组和重组AAV组相比差异有统计学意义(P<0.01)；空病毒组相和重组AAV组相比差异有统计学意义(P<0.01)；FITC-PI流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示空病毒组凋亡比例(2.77±1.80)％；重组AAV组细胞凋亡比率为(28.22±1.88)％；两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。　　 结论：pAAv-siRNA-E2F3重组病毒载体能够高效的转染PC3细胞并能够使肿瘤细胞阻滞在G1期，导致前列腺癌细胞系增长速度减慢，促进细胞的凋亡。本实验可能为后续的以E2F3为靶点的前列腺癌基因治疗体内实验提供一定的理论依据。