利用组织芯片和蛋白质组学技术分析和探讨乳腺癌耐药和转移的相关性

摘要

目的： 多药耐药和转移的发生是临床上肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。尽管在过去几十年中对恶性肿瘤的这两种特性已经进行了广泛研究，但是大多数只是把其做为两种单独的生物学行为进行研究。近来越来越多的证据表明这两种表型之间存在着一种功能上的联系：首先是从亲本细胞中筛选出来的耐药细胞系具有更强的侵袭和转移能力，此外对一些转移性肿瘤的研究发现转移灶细胞比原发瘤的耐药性明显增强，而这与临床上所观察到的发生转移的肿瘤患者化疗效果较差以及化疗效果不好的肿瘤患者容易出现转移的结果相一致。因此，这种肿瘤细胞耐药可以增强其转移能力和转移能力较强的肿瘤细胞表现出更强的耐药现象表明，在肿瘤的进展过程当中，耐药和转移的进展可能不是单独发生的，两者之间可能存在一种功能上的联系。因此，对肿瘤细胞耐药和转移相关性的正确理解可以导致更有效的肿瘤治疗。 由于肿瘤的多药耐药和侵袭转移是异质性的，不同的肿瘤的耐药和转移机制不同，耐药和转移的发生是多个基因多个通路表达的结果；而传统的研究方法只研究某一独立的生化传导通路、基因或蛋白质，这样的方法用来研究复杂的肿瘤多药耐药性和转移显然是不全面的；因此，有必要采用能够获得全面生物学信息的研究工具，进而可以全面完整的获取肿瘤细胞耐药和转移相关的生化传导通路，使我们更加深入的理解肿瘤耐药和转移的作用机制，探索新的治疗耐药肿瘤的作用靶点。 基于此，本研究采用组织芯片和蛋白组学的高通量研究技术来分析和探讨乳腺癌耐药和转移的相关性，并筛选和鉴定乳腺癌耐药和转移相关蛋白质，以揭示乳腺癌多药耐药与转移发生之间的相关分子机制。 方法： 第一部分： 1、以人乳腺癌细胞系MCF-7和由阿霉素诱导的耐药株MCF-7/ADR为模型，采用免疫细胞化学和RT-PCR等方法研究乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR中Twist的表达与EMT现象之间的相关性； 2、采用组织芯片技术检测乳腺癌组织耐药相关蛋白MDR1、MRP、LRP和GST-π以及肿瘤转移相关因子MMP2、MMP9和MMP13的表达以初步分析肿瘤耐药和转移之间的相关性。 第二部分： 1、人乳腺癌细胞系MCF-7和由阿霉素诱导的耐药株MCF-7/ADR为模型，分别提取两种细胞总蛋白，通过双向凝胶电泳分离，第一向采取固相pH梯度等电聚焦电泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后进行硝酸银和考马斯亮蓝染色。通过ImageMaster双向电泳图像分析软件对2DE图谱进行数字化分析匹配与对比，寻找差异表达蛋白质。 2、采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MADI-TOF/MS)技术对差异蛋白进行肽质量指纹图谱解析，获取差异蛋白点肽指纹图谱(PMF)。 3、应用生物信息学的方法进行数据库搜索，初步鉴定差异蛋白质，并对蛋白质的功能进行初步分析。 结果： 第一部分： 1、亲本细胞MCF-7中E-cadherin mRNA的表达和蛋白水平的表达均为阳性，Twist和N-cadherin表达阴性；多药耐药株MCF-7/ADR中E-cadherin mRNA和蛋白表达缺失，而在亲本细胞MCF-7中不表达的Twist和N-cadherin则表达阳性 2、乳腺癌组织中MDR1和LRP的表达与淋巴结状态密切相关(p值均小于0.05)；乳腺癌组织中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达与肿瘤大小有关(p值均小于0.05)，与临床TNM分期和淋巴结转移状态密切相关(p均<0.01)；乳腺癌中MMP-13的表达与临床TNM分期、淋巴结转移状态密切相关(p均<0.01)。 3、MRP的表达与MMP9的表达呈高度正相关(P=0.004)；MDR1的表达与MMP9的表达呈高度正相关，(P=0.000)；MDR1的表达与MMP13的表达呈高度正相关(P=0.001)；LRP的表达与MMP2的表达呈现高度正相关(P=0.001)； 第二部分： 1、初步建立和优化了双向电泳技术，并获得了比较清晰的电泳图谱。图像分析显示两种细胞来源的双向凝胶电泳图谱非常相似，蛋白点位置重复性较好。乳腺癌细胞MCF-7细胞2D图谱可识别的点为868±25，MCF-7/ADR为879±19。以MCF-7双向凝胶电泳图谱作为参考胶，MCF-7/ADR中平均匹配蛋白点为777个，蛋白点匹配率为89.6％。 2、MCF-7和MCF-7/ADR细胞中一共发现有67个差异蛋白点，其中在MCF-7中特异表达上调的有46个；在MCF-7/ADR中特异表达上调的21个。另外一共有6个点在MCF-7细胞中表达缺失，在MCF-7/ADR中表达缺失的有2个。 3、通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱成功获得了10个蛋白点的肽指纹图谱，并对部分蛋白点进行了二级质谱的解析。 4、应用生物信息学的方法，通过数据库搜索成功地鉴定了11个蛋白质。其中在MCF-7细胞中表达增高的蛋白质为：NADPH-flavin reduetase，Ras-relatednuclear protein 和fructose-1,6-bisphosphatase；在MCF-7/ADR中表达增高的蛋白质为：cytidine 5’-monophosphate N-acetylneuraminic acid synthetase，Annexin A2，Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1，KRT1 protein，hypothetical protein，beta2-microglobulin，kininogen 1和beta-gonadotropin。 结论： 1、在多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR中，其侵袭力增强可能与Twist介导的EMT发生有关。 2、组织芯片结果显示：MDR1和LRP的表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关；耐药相关蛋白与肿瘤转移相关因子的表达密切相关。因此我们推断在肿瘤进展过程当中，肿瘤耐药和转移的发生也许不是一个孤立的事件，两者之间可能存在着一种功能上的联系，耐药乳腺癌转移能力增强的机制可能是通过提高乳腺癌组织中基质金属蛋白酶的表达水平而实现的。 3、成功地建立了双向凝胶电泳分离细胞总蛋白的方法和生物信息学分析肽质量指纹图谱的方法。 4、初步的分析了乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR细胞和MCF-7细胞存在的差异表达蛋白质，分别涉及肿瘤转移、能量代谢、细胞增殖等。进一步明确了在肿瘤的进展过程当中，肿瘤转移和耐药的发生可能不是单独发生的，两者之间可能存在一种功能上的相关性，筛选出的相关蛋白质为下一步研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分：乳腺癌耐药与转移相关性的初步分析和探讨

一、实验材料

二、技术路线

三、方法步骤

四、结果

五、讨论

第二部分：双向电泳技术的建立和乳腺癌耐药和转移相关蛋白质的筛选

一、实验材料

二、技术路线

三、方法步骤

四、结果

五、讨论

小结

参考文献

发表论文和参加科研情况

致谢