水稻抗稻瘟病基因Pid3的抗性同源基因发掘与人工进化研究

摘要

稻瘟病是水稻最为严重的病害之一,利用含有抗病基因的水稻品种是一种有效且环保的防治稻瘟病危害手段.迄今已经定位的抗稻瘟病基因有70多个,其中24个已被克隆.目前克隆的抗稻瘟病基因绝大多数都属于NBS-LRR(NucleotideBinding-siteLeucine-richRepeat)类型,并且很多都是处于同一位点的等位基因或复等位基因.抗稻瘟病基因Pid3是利用假基因化分子标记在籼稻品种地谷中克隆的典型CC-NBS-LRR基因,该基因在粳稻和杂草稻中的同源基因普遍提前终止,但提前终止位点在野生稻与籼稻中没有检测到.　　鉴于目前已经克隆的这些抗稻瘟病基因特点,本研究利用等位发掘的方法在野生稻和栽培稻中共克隆了41个Pid3同源基因,并将其中11个进行了以感稻瘟病水稻品种1P309为背景的基因转化.对转基因植株抗性鉴定发现来自多年生普通野生稻A4、38-1、40-1和籼稻品种9311、kasalath中的Pid3同源基因具有抗稻瘟病功能:在检测过的一百多个稻瘟病菌小种里面,来自籼稻品种9311中的9311-Pid3抗谱与Pid3相同,其他4个同源基因的抗谱则各不相同,并且来自多年生普通野生稻A4中的A4-Pid3在检测过的稻瘟病菌小种中具有最广的抗谱.最后经检测发现9311-Pid3基因在我国籼稻育种中已经得到广泛利用,而Pid3及其同源基因在粳稻育种中还有很大的利用空间.　　9311-Pid3与野生稻40-1-Pid3对稻瘟病菌具有不同的抗谱,它们在预测的蛋白序列上的差异只出现在LRR区域,预示着LRR区域在这两个基因间对稻瘟病菌小种特异识别方面起作用.经过对Pid3同源基因间LRR区域的互换重组,发现野生稻38-1-PID3与地谷PID3间对稻瘟病菌小种特异识别区域是CC-NBS;38-1-PID3与A4-PID3间以及A4-PID3与地谷PID3间主要由CC-NBS区域起小种特异识别作用,但LRR区域也会产生一定影响.在对地谷中Pid3基因与野生稻15-3-Pid3基因进行LRR区域互换重组研究时,发现重组基因DG15出现了植株矮化表型,经抗性鉴定表明其仍具有抗稻瘟病功能;在对Pid3基因MHD保守模体点突变体研究中也发现有植株矮化表型出现,但这种突变体却并不抗病,与这两种突变类似的其他突变体以前在烟草叶片中作瞬时表达研究时常常都归为自发HR(HypersensitiveResponse)反应,本研究结果表明它们的分子机制可能是不相同的.　　由于绝大多数抗稻瘟病基因都属于NBS-LRR类型,本研究利用这一结构特点对抗稻瘟病基因的人工进化做了初步探索.将Pid3基因与同属于CC-NBS-LRR类型的广谱抗稻瘟病基因Pi9以及抗稻瘟病QTLPb1做了不同结构域间的互换重组,在这些重组基因中,发现Pid3Pi9、Pid3aPi9、Pid3aPb1、Pid3aaPb1仍然具有抗稻瘟病功能,尽管这些重组基因的抗性没有重组前的基因强,但这些结果说明不同抗稻瘟病基因间人工重组进化是可行的.同时为了探索大规模人工进化抗稻瘟病基因的途径,本研究利用multisitegateway技术成功构建了Pid3基因的3片段重组基因,尽管此基因目前未检测到具有抗稻瘟病功能,但我们相信此重组技术将会为大规模人工进化抗稻瘟病基因提供技术支持.　　最后本研究将得到的Pid3同源基因进行了杂交聚合,还利用组织特异性表达启动子PD540(-544)将Pid3基因进行了水稻绿色部位特异表达,使其在水稻胚和胚乳中不表达,进行了一些抗稻瘟病基因转基因生物安全方面的研究探索.

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