中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的研究

摘要

背景与目的:DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在CpG岛，CpG岛指观测值/期望值大于0.6并且GC含量大于50％的200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中60％～90％的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1是一重要的DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ将pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收GSTP1启动子区片段，在SssⅠ甲基化酶的作用下将所有CpG位点甲基化，并用Hpa Ⅱ酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的GSTP1启动子区片段与载体利用T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1pro<'m>。利用转染试剂将pGL3-GSTP1pro<'m>转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物CDP和5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒pGL3-GSTP1pro<'m>经KpnⅠ、Xho Ⅰ双酶切得到的完全甲基化的GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa Ⅱ酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后72h，启动子区转录活性明显升高，10 μ mol/L、30 μ mol/L、50μ mol/L CDP给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为6.35,10 μ mol/L、30 μ mol/L、50 μ mol/L CDP给药组相对荧光素酶活性均值分别为18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染MCF-7细胞，证实中药成分CDP能够逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子区的低转录活性。

目录

论文说明：本文所用的缩略词及全称

声明

第一部分中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的研究

前言

试验材料

实验方法

结果

讨论

第二部分利用酵母双杂交系统验证与CTCF相互作用的蛋白质

材料与方法

实验方法

结果

讨论

综述 DNA甲基化、DNA甲基转移酶及其抑制剂

参考文献

致谢