新生SD大鼠实验性缺氧缺血脑组织内源性神经干细胞增殖及BRCA1基因的调控作用研究

摘要

第一部分新生鼠缺氧缺血性脑损伤动物模型的建立和内源性神经干细胞表达变化的时空性研究 目的：建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemie brain damage，HIBD)动物模型。研究内源性神经干细胞(neural stem cells，NSCs)在新生鼠生理状态下表达的时空性变化和缺氧缺血性脑损伤时的激活增殖情况。 方法：采用SPF级，11—15克体重的7日龄新生SD大鼠做研究对象。实验动物随机分为HIBD组和假手术对照组，每组8只。取HIBD后12h,1d,3d,7d和14d为观察点。经双线结扎右侧颈总动脉及8％氧气的低氧处理2h，建立缺氧缺血性脑损伤动物模型，光镜和电镜做病理学检验观察病变。用免疫荧光法检测对照组和HIBD后巢蛋白(nestin)的表达变化。 结果：①HIBD后12—24h，神经元细胞出现肿胀变性；HIBD后3d，细胞排列更加紊乱，出现核固缩、细胞浓染。HIBD后1d电镜下细胞突触减少，线粒体肿胀。②.对照组在荧光显微镜下见到侧脑室和海马区出现胞浆绿色荧光，为异硫氰酸荧光素(F1uorescein isothiocyanate，FITC)标记的nestin。侧脑室区nestin荧光强度之间两两比较，差异无统计学意义(p>0.05)。海马区nestin荧光强度之间两两比较，差异无统计学意义(p>0.05)。各时间点侧脑室和海马区荧光强度比较，侧脑室区高于海马区(P<0.05)，差异有统计学意义。③．HIBD后与对照组比较，nestin荧光强度1d开始升高，3d明显升高，7d、14d逐渐下降，P均<0.05。HIBD后各时间点侧脑室和海马区nestin荧光强度比较，P均<0.05，差异有统计学意义。 结论：①将7日龄SD大鼠经单侧颈总动脉结扎及8％低氧处理，可以成功建立HIBD模型。②生理状态下，脑组织有神经干细胞存在，以侧脑室和海马区为主，侧脑室神经干细胞相对集中；神经干细胞处于稳定表达状态。③HIBD可激活内源性神经干细胞表达，损伤后3d明显。 第二部分新生鼠实验性缺氧缺血脑组织BRCAlmRNA和BRCAl蛋白表达及意义 目的：观察乳腺癌易感基因(breast cancer suscepfibility gene，BRCAl)mRNA和BRCAl蛋白在HIBD后脑组织中的表达变化，探讨其意义。 方法：采用实时荧光定量PCR法检测BRCAlmRNA在对照组和HIBD后脑组织中的表达；采用免疫印迹法(Westem Blot)检测BRCAl蛋白在对照组和HIBD后脑组织中的表达。 结果：①HIBD新生鼠脑中BRCAlmRNA表达与对照组相比，12h开始升高，1d明显升高，3d、7d逐渐下降，P均<0.05。②BRCAl蛋白表达与对照组比较，在HIBD后12h-24h开始升高，3d明显升高，7d逐渐下降，P均<0.05。 结论：①HIBD新生SD大鼠脑组织中BRCAlmRNA和BRCAl蛋白均呈现先上升后下降的趋势。②新生SD大鼠脑组织在生理和HIBD后，均有神经干细胞和BRCAl基因和蛋白的表达，损伤后表达增高。三者变化趋势一致。 第三部分雌激素干预BRCAl基因表达对新生SD大鼠实验性缺氧缺血神经干细胞增殖影响的研究 目的：观察雌激素(17 β-estradiol，17β-E2)干预BRCAlmRNA表达后，内源性神经干细胞增殖的变化情况，初步探讨BRCAl基因与神经干细胞增殖的关系。 方法：取HIBD后3d为观察点。新生鼠分为6组：假手术对照组、单纯HIBD组、使用橄榄油的空白对照组、使用低浓度E2组、使用中浓度E2组、使用高浓度E2组。雌激素干预组每天给予颈部皮下注射雌激素一次，共3d。用实时荧光定量PCR法检测BRCAl mRNA表达。5-溴脱氧尿苷嘧啶(bromodeoxyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶脱氧核酸类似物，可在有丝分裂的S期掺入DNA的合成，故常用Brdu阳性来检测细胞的增殖。为同时检测神经干细胞的增殖变化情况，给试验动物腹腔注射Brdu(50mg／kg，每天2次，共3天)，用免疫荧光法检测海马区Brdu阳性细胞数了解海马区神经干细胞的增殖变化。对BRCAlmRNA与神经干细胞增殖之间的关系做相关性分析。 结果：①随着使用雌激素浓度升高，BRCAl mRNA表达升高，使用高浓度E2组BRCAl mRNA表达最高。各组间比较P均<0.05，差异有统计学意义。②海马区荧光素罗丹明(Rhodamine)标记的呈红色荧光的Brdu阳性细胞数在使用雌激素后增多，以使用高浓度E2组明显。各组间比较P均<0.05，差异有统计学意义。⑧经相关性分析，BRCAlmRNA表达与神经干细胞增殖呈正相关(r=0.47)。 结论：①雌激素可以上调脑组织中BRCAlmRNA的表达，呈剂量效应关系。②雌激素干预后，神经干细胞出现增殖反应。③BRCAl基因可能在神经干细胞增殖中起正向调控作用。

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英语缩略词表

前 言

第一部分新生SD大鼠实验性缺氧缺血脑组织神经干细胞的表达

第二部分 新生SD大鼠实验性缺氧缺血脑组织BRCA1的表达研究

第三部分雌激素干预BRCA1基因表达对新生SD大鼠缺氧缺血性脑损伤神经干细胞增殖影响的研究

综述神经干细胞及其调控因素研究进展

参考文献

致 谢