非酒精性脂肪性肝病大鼠肝内蛋白激酶B表达的变化及N-乙酰半胱氨酸、褪黑素干预的研究

摘要

目的:建立非酒精性脂肪性肝病模型，观察非酒精性脂肪性肝病大鼠血清转氨酶、血糖，肝内脂质，SOD、MDA、GSH-PX以及肝脏形态学、肝内PKB、P-PKB表达的变化以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)、褪黑素(MT)对上述指标的影响。 方法: 1.(NAC部分)80只雄性Wistar大鼠随机分成5组每组16只：正常对照组予普通饲料饮食、模型组和NAC低、中、高3个剂量组予高脂饲料饮食10周。各NAC组分别给予NACl 0 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)，正常组和模型组分别给予等量的生理盐水，每日一次定时灌胃。10周后处死，处死前各组随机选取半数大鼠门静脉注射胰岛素，剂量为2.5U。称肝湿重并计算肝指数，观察肝脏病理形态学改变,生化法检测大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)，肝匀浆TC、TG，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)、免疫组化法测定肝脏蛋白激酶B、磷酸化蛋白激酶B(PKB、P-PKB)的表达以及P-PKB/PKB比值。 2.(MT部分)分组、给药及标本收集来源前期研究，具体方法：将50只雄性wistar。大鼠随机分成5组每组10只：正常对照组给予普通饮食、模型组和低、中、高3个剂量褪黑素组给予高脂饮食。褪黑素组分别给予褪黑素2.5 mg/(kg·d)、5.0mg/(kg·d)和10.0mg/(kg·d)剂量，正常组和模型组每日一次给予等量的生理盐水(内含1％无水乙醇)腹腔注射。12周后处死，检测指标同NAC部分。 结果: 1.(NAC部分)10周高脂饮食成功复制大鼠NAFL/NASH模型。与正常对照组比较，模型组大鼠肝湿重及肝指数增加(P<0.05)，肝细胞呈明显脂肪变性，肝小叶内见炎性细胞浸润和点状坏死，炎症积分明显升高(P<0.01)；血清ALT、AST、TC、GLU以及肝匀浆TC、TG、MDA值升高(P<0.05)，肝匀浆SOD、GSH-PX值降低(P<0.05)。未注射胰岛素和注射胰岛素的模型组肝内PKB、P-PKB表达及P-PKB/PKB比值均分别低于未注射胰岛素和注射胰岛素的正常组(P<0.05)。胰岛素注射正常组PKB、P-PKB表达及P-PKB/PKB比值分别较非胰岛素注射正常组明显升高(P<0.05)。胰岛素注射模型组PKB、P-PKB表达及P-PKB/PKB比值分别为较非胰岛素注射模型组升高，但差异无显著性(P>0.05)。与模型组比较，NAC中高剂量组肝湿重、肝匀浆MDA值降低，肝匀浆SOD，GSH-PX水平升高(P<0.05)：NAC高剂量组肝指数、血清AST、血GLU、肝匀浆TC，TG降低(P<0.05)。未注射胰岛素和注射胰岛素的NAC中、高剂量组大鼠组肝内PKB、P-PKB表达及P-PKB/PKB比值均分别高于未注射胰岛素和注射胰岛素的模型组(P<0.05)。胰岛素注射的NAC中、高剂量组PKB、P-PKB表达及P-PKB/PKB比值分别较非胰岛素注射的NAC中、高剂量组明显升高(P<0.05)。 2.(MT部分)与正常对照组比较，模型组大鼠肝湿重及肝指数明显增高(P<0.01)：肝细胞呈脂肪变性，肝小叶内见灶性炎细胞浸润和点状坏死，炎症积分明显升高(P<0.01)，血清ALT、血GLU(P<0.05)，AST，TC值(P<0.01)以及肝匀浆TC、TG、MDA值明显升高(P<0.05)；肝匀浆SOD、GSH-PX水平明显降低(P<0.05)；肝脏PKB、P-PKB表达，P-PKB/PKB比值明显下降(P<0.05)。与模型组相比，MT中、高剂量组肝湿重及肝指数(P<0.05，P<0.01)，MT高剂量组血清AST降低(P<0.05)。MT中、高剂量组肝脏TC和高剂量组TG低于模型组(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；肝细胞脂肪变性、肝小叶内炎症细胞浸润明显减轻(P<0.01)。肝匀浆SOD、GSH-PX水平升高、MDA值降低(P<0.01)。MT中、高剂量组PKB、P-PKB表达及高剂量组P-PKB/PKB值升高(P<0.05)。 结论: NAFL/NASH大鼠肝组织PKB、P-PKB的表达以及P-PKB/PKB比值下降，对胰岛素的敏感性下降，提示NAFL/NASH大鼠肝内存在胰岛素抵抗和PKB表达异常。NAC、MT可降低NAFL/NASH大鼠血清AST水平、血GLU、TC，减少肝内脂质沉积以及改善肝脏病理学变化，对NAFL/NASH具有保护作用，这种作用可能与抗氧化应激和上调肝内PKB表达或/和改善肝内胰岛素抵抗有关。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘要

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.1.1动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器、设备

2.2实验方法

2.2.1 NAC对大鼠非酒精性脂肪肝性肝病的影响的研究

2.2.2 MT对大鼠非酒精性脂肪肝性肝病的影响的研究

2.2.3大鼠血清生化检测

2.2.4肝匀浆SOD，GSH-PX活力和MDA含量的测定方法

2.2.5肝组织病理结果评分

2.2.6 PKB、P-PKB的免疫组化染色方法

2.2.7免疫组化结果判断

2.3数据处理和统计分析

3结果

3.1大鼠NAFL/NASH模型的建立

3.1.1 NAC干预研究部分

3.1.2 MT干预研究部分(生化和病理学检查结果系前期研究结果)

3.2 NAC、MT对NAFL/NASH大鼠的干预研究

3.2.1 NAC对NAFL/NASH大鼠的干预研究

3.2.2 MT对NAFL/NASH大鼠的干预研究

4讨论

4.1 NAFL/NAsH模型的建立

4.2大鼠NAFL/NASH肝匀浆中SOD、GSH-PX、MDA水平变化

4.3大鼠NAFL/NASH血糖、肝脏PKB、P-PKB的表达以及P-PKB/PKB比值的变化

4.4 NAC和MT对NAFL/NASH形成中的干预作用

4.4.1 NAC、MT对NAFL/NASH大鼠转氨酶，脂质以及肝脏病理的影响。

4.4.2 NAC、MT对NAFL/NASH大鼠肝脏SOD、GSH-PX、MDA含量的影响。

4.4.3 NAC、MT对NAFL/NASH大鼠血GLU水平及肝脏PKB、P-PKB的表达、P-PKB/PKB比值的影响

5结论

参考文献

个人简历

致谢

综述 非酒精性脂肪性肝炎的药物治疗

附图